石蠟切片或細胞的原位雜交實(shí)驗

實(shí)驗材料：石蠟切片

試劑、試劑盒：HCl二甲苯乙醇SSCPBS鏈霉蛋白酶甘氨酸DTTRNA酶消化液乙酸銨

儀器、耗材：染色盤(pán)加濕盒載玻片烘箱水浴鍋培養箱

實(shí)驗步驟： 
1.準備脫蠟/再水化系統（可重復使用數次）及0.2mol/l HCl同時(shí)，將載有切片樣品的載玻片（玻片盒中，于-20℃或-70℃貯存）置室溫。開(kāi)始預熱2×SSC至70℃（步驟5中使用）。
2.在加有二甲苯的染色盤(pán)中進(jìn)行切片脫蠟，更換二甲苯3次，毎次同隔2min（對載有未經(jīng)包埋單細胞的玻片則無(wú)必要）。 
3.通過(guò)如下各組染色盤(pán)進(jìn)行再水化。100%乙醇2次，每次2min；95%乙醇2 min；70%乙醇2min，50%乙醇2 min。 
4.樣品室溫下于0.2 mol/l HCl中變性20 min。
5.樣品在70℃ 2×SSC中熱變性15min，浸于1×PBS，2min。
6.在新配制的4%PFA固定液中進(jìn)行樣品后固定，置室溫5min。于3×PBS中終止固定3min，繼以1×PBS浸2次，每次30s。
7.在含10mmol/lDTT的1×PBS中平衡樣品，置45℃水溶10min。
8.以新配制的封阻液進(jìn)行封閉。置45℃水浴30min，水浴時(shí)用鋁箔覆蓋（碘乙酰胺對光敏感）。
9.室溫下，以1×PBS浸洗2次，每次2min。
10.于新配制的TEA緩沖液中，平衡樣品2min，移玻片架于新的TEA緩沖液中，并加乙酸酐至0.25%終濃度�？焖倩旌�，并在攪拌情況下，浸泡玻片5min。再加乙酸酐至0.5%終濃度，再浸泡5min。
11.樣品移至2×SSC中浸泡5min。
12.分別以50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇（2次）浸泡進(jìn)行樣品脫水。室溫下，每次2min（用步驟3乙醇溶液）。
13.空氣干燥樣品（或于干燥器中干燥）繼續實(shí)驗前應確證樣品絕對干燥，樣品放在加有干燥劑的玻片盒中，于-70℃干貯。
14.離心乙醇沆淀的反鏈及正鏈35S標記的核酸探針以及S-核糖核酸探針競爭物。沉淀干后，以5μl 無(wú)菌的5mmol/l DTT溶解沉淀。加2.5μl（反應的半量）S-核糖核酸探針競爭劑于反鏈及正鏈核糖核酸探計中。
15.100℃加熱3min，使探針變性。
16.立即加足量雜交液A，使探針終濃度為0.3μg/ml，充分混合。測定放射活性（期望放射活性計數值≥1×105cpm/μl）。將管置45℃水�。�雜交溫度）。
17.小心在標本上鋪加適量探針（如用加樣吸頭，按20μl/20 mm3 鋪加，開(kāi)始雜交）。
18.置樣品于加濕盒中（載玻片水平放置），加濕盒內加入加濕盒溶液A，于 45℃溫育雜交適當時(shí)間。雜交時(shí)間可進(jìn)行30 min~4 h（須平衡濕盒內液體并小心密封濕盒，因為如果樣品干了，將導致高雜交本底出現，加濕盒溶液與雜交混合液的滲透壓必須相同，以防止雜交液稀釋或濃縮）。
19.雜交過(guò)程最后一小時(shí)期間，準備并預熱洗液A、B、C。
20.開(kāi)始洗玻片，將載玻片浸入55℃ 100ml 洗液A中，立即放入玻片架并放入盛有溶液A的染色盤(pán)中。
21.在55℃溶液A中洗2次，每次15min 繼續在55℃溶液B中洗2次，每次15min。然后，室溫下，以溶液C洗2次，每次2min。
22.每一玻片上加500μl RNA酶消化液，覆蓋樣品全部，將玻片放入加濕盒中（盛有水），標明RNA酶專(zhuān)用。室溫放置15min。
23.在50℃洗液C中，緩慢振搖洗玻片2次，每次30min。再于50℃洗液A中，緩慢搖洗玻片2次，每次30min 繼續在室溫下，以2×SSC洗玻片2次，毎次5min。
24.經(jīng)以下各組液體中（毎次2min）進(jìn)行脫水處理：50%乙醇 / 0.3mol/l 乙酸銨、70%乙醇 / 0.3mol/l 乙酸銨、90%乙醇 / 0.3mol/l 乙酸銨、100%乙醇。
25.空氣中干燥載玻片。壓膠片曝光至少過(guò)，然后進(jìn)行乳膠放射自顯影。

注意事項： 
1.以上所有步驟均是將承有樣品的載玻片置于玻片架中，并在盛有指定溶液的玻璃染色盤(pán)中進(jìn)行，除非另有說(shuō)明，所有溶液均為新配制，并只使用一次。
2.碘乙酰胺和N-乙基馬來(lái)酰亞胺為劇毒物，應小心操作。