蛋白質(zhì)純化離子交換法

　　各種蛋白質(zhì)分子上可能帶有?同的電性，經(jīng)過(guò)離子交換管柱，可依其分子帶電性的差異而分離開(kāi)? (Pharmacia 操作手冊, Ion Exchange)。

　　儀器設備：

　　塑料管柱 (Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)

　　分劃收集器 (fraction collector, 另需準備干凈試管約60 支)

　　濃縮用離心機 (低速5,000 rpm) 及濃縮離心管Centriplus

　　藥品試劑：

　　DEAE Sephacel (膠體體積約15 mL，預先以緩沖液Buffer A-0 平衡好)

　　Buffer A-0 (如上述配法)

　　Buffer A-300 溶離液：Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

　　Buffer A-500 溶離液：Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

　　方法步驟：

　　1) 將Econo-Pac 管柱架好，并將三向閥及軟管等組合完成。

　　2) 震蕩DEAE Sephacel 膠體使的懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢??，在??過(guò)程中隨時(shí)加入buffer A-0，勿使膠體干掉。

　　3) 待膠體??完全后，高?應在15 cm 左右。膠柱以buffer A-0 一直?洗，?速快慢可以?考慮;連接好收集器，每試管收2.5 mL。離子交換法的膠體平衡極為重要，可測?出液的pH 或離子濃?，看是否與buffer A-0 相同，??一樣則需要再?洗的。

　　4) 樣本的添加方法同上述膠體過(guò)濾法，并啟動(dòng)分劃收集器開(kāi)始收集，當樣本全部沒(méi)入膠體后，再加入同體積buffer A-0。以buffer A-0 ?洗50 mL 后，去除膠體上方的緩沖液，但勿使膠體干掉。

　　5) 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶離的，每批次?洗各50 mL，注意?換濃?時(shí)，膠體上方勿殘存上一種溶液。

　　6) 收集所有分劃，進(jìn)?蛋白質(zhì)定?分析以及GUS 活性測定，結果作圖。

　　7) 收集GUS 活性區，并以Centriprep-30 濃縮至 _______ mL (IEX)，記得要保?100 μL。

　　8) 離子交換膠體以buffer A-0 洗過(guò)50 mL 后，收起?交回。