細胞培養法闡述

　　二倍體細胞培養法二倍體細胞培養法與一般培養相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序為：

　　1.吸除舊培養液注入另瓶中。

　　2.用溫BSS沖洗1次。

　　3.用0.25%溫胰蛋白酶消化，加入消化液量以?xún)H覆蓋細胞層即可;作用1~5分鐘。

　　4.待細胞附著(zhù)松動(dòng)、細胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細胞丟失，可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養液(新舊培養液按2：1新舊混合)。

　　5.輕輕反復吹打制成單個(gè)細胞懸液。

　　6.按一分為二比例接種培養。

　　2)支持物培養法加支持物培養法與一般培養法相同，只是在培養前需在培養瓶中加入已經(jīng)消毒的支持物。

　　1.支持物制備：如用特氟隆薄膜，無(wú)菌條件下啟封，用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊，于培養接種細胞前，先置入培養容器中即可;通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，以便裝入培養瓶中，然后按如下順序處理：自來(lái)水浸泡24小時(shí)—96%酒精30～60min—蒸餾水浸泡 30～60min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養皿中—高壓或干熱滅菌備用。

　　2.培養法：初代消化培養、初代組織塊培養、傳代培養等皆可應用加支持物培養法。接種細胞后，可在任何時(shí)間取出支持物，做各種觀(guān)察或實(shí)驗。3)細胞分離(克隆)培養多孔塑料培養板單細胞克隆法：1.消化：取健康待克隆細胞，吸出瓶?jì)扰囵B液，加消化液。

　　3.低密度細胞懸液的制備：做克隆細胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細胞懸液，然后稀釋細胞，使之成為1~2細胞/毫升懸液，最適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養液。

　　4.接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養板每孔內加0.5毫升。接種時(shí)要迅速準確，爭取在最短時(shí)間內加完，以免培養液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養。

　　5.標記：培養6~12小時(shí)后，待細胞下沉冰貼附于培養板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺上，觀(guān)察和標記下含有單個(gè)細胞的孔，置CO2溫箱培養。在培養中一般無(wú)需換液，只有在細胞增長(cháng)過(guò)于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養基，但不要吸除過(guò)多，余少許，以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養液，繼續培養3~4周。待孔內細胞增至500~600個(gè)時(shí)，可進(jìn)行分離培養。

　　6.分離擴大培養：培養86~96小時(shí)后進(jìn)行觀(guān)察。挑選生長(cháng)良好的單細胞克隆孔，先吸除舊培養液，用Hanks洗1~2次，繼加胰蛋白酶少許，加入量已能覆蓋細胞群即可，如過(guò)多，應吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現細胞變圓時(shí)，加入0.1ml含10%血清的克隆培養基，用吸管輕輕吹打，當細胞離開(kāi)底物懸浮后，一并吸入管內，移入另瓶或皿中，再補加一定量克隆培養液，置CO2溫箱中繼續培養、增殖，使之形成新的細胞群后，即轉用常規培養法培養。必須保證分離出來(lái)的細胞確為一個(gè)而不是兩個(gè)或更多。因此必須提高克隆形成率才易克隆成功，為此常采取以下一些措施：使用適應性培養基或條件培養基(ConditionalMedium)。

　　細胞培養制備方法：

　　1.培養同源細胞(未克隆前時(shí)的同一細胞)至半匯合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養液，再繼續培養24~48小時(shí)后，吸出所有培養液。

　　2.離心：3000~4000/分離心10分鐘，吸取上清液。

　　3.濾過(guò)：再經(jīng)直徑0.22μm濾孔的濾膜過(guò)濾，低溫凍存貯備用;用時(shí)取1分適應培養基+2分培養基混合使用。使用飼細胞(FeederCells)。

　　4)球體細胞培養瓊脂鋪底的培養瓶：30ml無(wú)菌培養瓶，每瓶中加5ml2%瓊脂培養基，冷卻，形成平坦底層后備用。取生長(cháng)狀態(tài)良好已連接成片的細胞，用彎頭吸管伸入瓶?jì)�，把細胞縱橫割劃成若干小區后，倒出培養液。加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀(guān)察，當細胞小區邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養液3~5ml，用吸管把已松動(dòng)的細胞片吸打下來(lái)，分裝入1~3個(gè)含2%瓊脂培養基底層的培養瓶中，置溫箱繼續培養，數日后便可生長(cháng)成細胞球體。換液：培養1~2日后，如需換液，微傾斜培養瓶，令培養液集于培養瓶底角，停片刻，待球體細胞下沉后，吸除部分培養液，再補充新培養液。

　　5)微載體細胞培養法

　　1.微載體選擇：先用利用三種小量微載體做培養實(shí)驗，觀(guān)察細胞在一定時(shí)間內細胞的吸著(zhù)率和計算細胞數，以得到最大量細胞為佳。

　　2.水化：稱(chēng)一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50～100ml的比例，加入無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)，室溫下放置應不少于3小時(shí)，并不時(shí)輕微攪動(dòng)，然后再用新鮮PBS洗一次。

　　3.消毒：可采用高壓蒸汽消毒，也可在水化后用70%酒精浸泡消毒，再用無(wú)菌的PBS漂洗一二次。

　　4.傳代培養：在連續進(jìn)行微載體培養時(shí)，可以不必把細胞從微載體分離下來(lái)，可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進(jìn)行培養細胞能移動(dòng)到新載體上。如果進(jìn)行其它實(shí)驗或需要分離細胞進(jìn)行傳代培養時(shí)，和常規培養相同，先用EDTA+胰蛋白酶溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后，可用自然沉降法，即在室溫下靜止5分鐘，微載體將先自沉在底部，細胞大部分仍在上清中，然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時(shí)，需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾后，再離心濾過(guò)液，就可得到較純凈的細胞。

　　6)懸浮培養法懸浮培養是使帖壁細胞呈懸浮狀態(tài)生長(cháng)。如所需培養的細胞本身屬懸浮生長(cháng)型，則無(wú)須做任何處理;在傳代時(shí)先做離心處理去除舊培養液，添加新培養液即可。但在培養帖附型細胞時(shí)，必須進(jìn)行干擾細胞不能帖附