實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

　　所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法.

　　1.在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個(gè)很重要的概念—— Ct值.C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個(gè)反應管內的熒光信號到達設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(如圖1所示).

　　Ct值的確定

　　2. 熒光域值(threshold)的設定

　　PCR反應的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,即:threshold = 10 SDcycle 6-15

　　3. Ct值與起始模板的關(guān)系

　　研究表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系〔1〕,起始拷貝數越多,Ct值越小.利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn),其中橫坐標代表起始拷貝數的對數,縱坐標代表Ct值(如圖2所示).因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數.

　　熒光定量標準曲線(xiàn)

　　4. 熒光化學(xué)

　　熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料〔2〕.現將其原理簡(jiǎn)述如下:

　　1)TaqMan 熒光探針:PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團.探針完整時(shí),報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.如圖3所示.

　　TaqMan 熒光探針工作原理

　　2)SYBR熒光染料:

　　在PCR反應體系中,加入過(guò)量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì )發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步.