分光光度計的應用常識

　　分光光度計已經(jīng)成為現代分子生物實(shí)驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長(cháng)濃度的定量。

　　分光光度計的簡(jiǎn)單原理

　　分光光度計采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(cháng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(cháng)的光源，光源透過(guò)測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

　　核酸的定量

　　核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能�？梢远�量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(cháng)260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。讀數不穩定可能是實(shí)驗者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

　　事實(shí)上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì )導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著(zhù)樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高(超過(guò)光度計的測試范圍)。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值;混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項。

　　除了核酸濃度，分光光度計同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于 1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

　　蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

　　這種方法是在280nm波長(cháng)，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開(kāi)”。與測試核酸類(lèi)似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線(xiàn)性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現讀數“漂移”。這是一個(gè)正常的現象。事實(shí)上，只要觀(guān)察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì )被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

　　比色法蛋白質(zhì)定量

　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數目直接相關(guān)，從而反應蛋白質(zhì)濃度。

　　比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

　　Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時(shí)間較長(cháng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

　　BCA(Bicinchoninine　acid　assay)法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562nm波長(cháng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系極強，反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

　　Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡(jiǎn)單，速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩定1小時(shí)，方便結果;而且與一系列干擾Lowry，BCA