分光光度計的應用常識

　　分光光度計已經(jīng)成為現代分子生物實(shí)驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長(cháng)濃度的定量。

　　分光光度計的簡(jiǎn)單原理

　　分光光度計采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(cháng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(cháng)的光源，光源透過(guò)測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

　　核酸的定量

　　核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能�？梢远�量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(cháng) 260 nm。 每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。讀數不穩定可能是實(shí)驗者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

　　事實(shí)上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì )導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。