RNA干擾技術(shù)及其應用

　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，它是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現象，這種現象發(fā)生在轉錄后水平，又稱(chēng)為轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。外源dsRNA 進(jìn)入細胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC具有結合和切割mRNA的作用而介導RNA干擾的過(guò)程。RNAi具有特異性和高效性。這種技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具，并將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發(fā)揮重要作用。

　　近年來(lái)，RNA干擾的研究成為熱點(diǎn)，預測未來(lái)10年間最有可能出重大成果的領(lǐng)域之一，并被《Science》評選為2002年度最重要科技突破的首位。RNAi是細胞本身固有的對抗外源基因及其侵害的一種自我保護現象，是雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應序列及基因的表達使其沉默的過(guò)程。RNAi技術(shù)的應用領(lǐng)域已經(jīng)從基因組學(xué)研究逐步擴展到醫學(xué)領(lǐng)域并作為基因治療手段。利用RNAi不僅能提供一種經(jīng)濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定和基因治療等方面開(kāi)辟一條新思路，因此包括動(dòng)物醫學(xué)在內的諸多領(lǐng)域的應用也有非常廣闊的前景。

　　1.RNA干擾的發(fā)現 1995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)的par-1基因時(shí)，發(fā)現了一個(gè)意想不到的現象。她們本想利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達，而同時(shí)在對照實(shí)驗中給線(xiàn)蟲(chóng)注射正義RNA以期觀(guān)察到基因表達的增強，但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire和麻省大學(xué)醫學(xué)院的Mello首次在秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)中證明上述現象屬于轉錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現象，以及過(guò)去的反義RNA技術(shù)對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線(xiàn)蟲(chóng)時(shí)發(fā)現，基因抑制效應變得十分微弱，而經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義RNA至少高2個(gè)數量級。該小組將這一現象稱(chēng)為RNA干擾。在1999年短短的一年間,發(fā)現RNA干擾現象廣泛存在于從植物、真菌、線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、蛙類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、大鼠、小鼠、猴一直到人類(lèi)的幾乎所有的真核生物中細胞。2000年，又先后發(fā)現小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現象。

　　2.RNA干擾的作用機制 當病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進(jìn)行轉錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應，其胞質(zhì)中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(cháng)度和結構的小片段RNA(大約21～23 bp)，即siRNA。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進(jìn)行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

　　RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說(shuō)明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會(huì )引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

　　RNAi干擾現象具有以下幾個(gè)重要的特征：①RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制;②RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應的單個(gè)內源基因的mRNA;③RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子(數量遠遠少于內源mRNA的數量)就能完全抑制相應基因的表達，是以催化放大的方式進(jìn)行的;④RNAi抑制基因表達的效應可以穿過(guò)細胞界限，在不同細胞間長(cháng)距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個(gè)有機體以及可遺傳等特點(diǎn);⑤dsRNA不得短于21個(gè)堿基，并且長(cháng)鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21 bp左右的siRNA，并由siRNA來(lái)介導mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳動(dòng)物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡;⑥ATP依賴(lài)性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現象降低或消失顯示RNA干擾是一個(gè)ATP依賴(lài)的過(guò)程�？赡苁荄iecer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。

　　3.常用的RNAi的研究策略

　　3.1直接合成針對靶基因的siRNA(合成的是RNA,不是DNA)，通過(guò)轉染(有用于siRNA轉染的試劑)的方法使之進(jìn)入細胞內，參與到RNAi途徑，發(fā)揮使靶基因沉默的效應。這一方法受轉染效率的影響較大，而且能順利的進(jìn)入RNAi途徑的效率怎么樣，還有待驗證。不過(guò)目前有不少基因的siRNA已經(jīng)有商業(yè)產(chǎn)品，所以使用時(shí)買(mǎi)來(lái)就可以了，比較方便。

　　而且直接合成的siRNA可以進(jìn)行小分子多肽等配體標記，可進(jìn)行體內研究，注入體內后，通過(guò)配體的識別，被特定的細胞吸收，在特定的靶細胞內實(shí)現RNAi研究。

　　3.2構建shRNA的質(zhì)粒表達載體shRNA的質(zhì)粒表達載體，轉染細胞，在細胞內轉錄生成shRNA,利用細胞內的Dicer酶，生成相應的siRNA，發(fā)揮RNAi作用。

　　3.3構建shRNA的病毒表達載體 常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體等，機制與質(zhì)粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點(diǎn)，解決了用質(zhì)粒載體轉染效率低的缺陷。

　　4.RNA干擾的應用 RNA干擾www.bnbiotech.com現象的發(fā)現及其在生物中存在的普遍性，以及RNAi作用機制和生物學(xué)功能的初步闡明，為RNAi的應用提供了理論基礎。RNAi目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號轉導等廣泛的領(lǐng)域里取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫學(xué)領(lǐng)域包括動(dòng)物醫學(xué)領(lǐng)域在內的應用有著(zhù)廣闊的前景。

　　4.1 研究基因功能的新工具 由于RNAi具有高度的序列專(zhuān)一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類(lèi)似基因敲除的效應。與傳統的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢，近來(lái)RNAi成功用于構建轉基因動(dòng)物模型的報道日益增多，標志著(zhù)RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。

　　4.2 病毒性疾病的治療 加州大學(xué)洛杉磯分校和加州理工學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)出使用RNAi技術(shù)來(lái)阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細胞。這個(gè)研究小組設計合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進(jìn)入人體外周T淋巴細胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導siRNA進(jìn)入細胞內產(chǎn)生了免疫應答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi還可應用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA已證實(shí)介導人類(lèi)細胞的細胞間抗病毒免疫，用siRNA對Magi細胞進(jìn)行預處理可使其對病毒的抵抗能力增強。在最近全世界約30個(gè)國家和地區散發(fā)或流行的嚴重急性呼吸綜合征