高效液相色譜使用過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

　　高效液相色譜技術(shù),HPLC 是近期發(fā)展起來(lái)的一種具有高靈敏度、高選擇性的高效快速分離、分析技術(shù).它既能用于微量組分的分析測定，又能用于大量的制備分離，靈活多樣，應用范圍已超過(guò)其它各種分離方法。如果HPLC使用人員能在分析樣品之時(shí)就熟悉常見(jiàn)的問(wèn)題并加以解決，就能避免許多麻煩，讓您在HPLC使用過(guò)程中輕松應對。

　　1 高效液相色譜儀系統

　　液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測器、數據處理系統組成(見(jiàn)圖1)。對于整個(gè)系統而言，柱子、泵和檢測器是核心部件，同時(shí)也是易出問(wèn)題的主要部位。

　　2 高效液相色譜儀常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

　　高效液相色譜儀作為一種高精密儀器，如果在使用過(guò)程中操作不當的話(huà),就容易導致一些問(wèn)題，其中最常見(jiàn)的就是柱壓?jiǎn)?wèn)題、漂移問(wèn)題、峰形異常問(wèn)題。

　　2.1 柱壓?jiǎn)?wèn)題

　　柱壓?jiǎn)?wèn)題是使用高效液相色譜過(guò)程中需要密切注意的地方，柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩定并不是指壓力值穩定于一個(gè)恒定值，而是指壓力波動(dòng)范圍在345kPa以?xún)?在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩、緩慢的變化是允許的)。壓力過(guò)高、過(guò)低都屬于柱壓?jiǎn)?wèn)題。

　　2.1.1 壓力過(guò)高

　　這是高效液相色譜儀在使用中最常見(jiàn)的問(wèn)題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的情況。此時(shí)，我們應該分段進(jìn)行檢查。

　�、偈紫葦嚅_(kāi)真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿(mǎn)液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過(guò)濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡0.5h，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過(guò)濾頭正常，再檢查。②打開(kāi)Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)柱子，如果壓力沒(méi)有明顯下降，則是過(guò)濾頭堵塞。處理方法：將過(guò)濾頭取出，用10%的異丙醇超聲30min。如果壓力降至690kPa以下，過(guò)濾頭正常，再檢查。③把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常;如果是一些強保留的物質(zhì)導致堵塞，則要用比現在流動(dòng)相更強的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(cháng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不慎，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。

　　2.1.2 壓力過(guò)低

　　壓力過(guò)低的現象一般是由于系統泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。當然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現的往往是壓力不穩，忽高忽低，更嚴重一點(diǎn)會(huì )導致泵無(wú)法吸進(jìn)液體。處理方法：打開(kāi)Purge閥，用3~5ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專(zhuān)用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

　　2.2 漂移問(wèn)題

　　主要包括基線(xiàn)漂移和保留時(shí)間漂移。

　　2.2.1 基線(xiàn)漂移

　　一般說(shuō)來(lái)，機器剛啟動(dòng)時(shí)，基線(xiàn)容易漂移，大概要30min的平衡時(shí)間，如果用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(cháng)下(220nm)平衡時(shí)間相對會(huì )比較長(cháng)，但如果在實(shí)驗過(guò)程中發(fā)現基線(xiàn)漂移，則要考慮下面的原因(見(jiàn)表1)。

　　2.2.2 保留時(shí)間漂移

　　保留時(shí)間重現是液相性能好壞的一個(gè)重要標志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過(guò)15s，超過(guò)了30s可看做保留時(shí)間漂移，就無(wú)法進(jìn)行定性，要考慮以下原因(見(jiàn)表2)。

　　2.3 峰形異常問(wèn)題

　　峰形問(wèn)題是液相的主要問(wèn)題，在做液相過(guò)程中，我們就是要變換不同的條件來(lái)改善不好的峰形，對于各種各樣的異常峰，要區別對待