微生物的分離與純化實(shí)驗

　　實(shí)驗原理：

　　培養基是人工按一定比例配制的供微生物生長(cháng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養物質(zhì)的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)因素、能源和水。根據微生物的種類(lèi)和實(shí)驗目的不同，培養基要選擇合適的配比關(guān)系;選擇合適的理化性質(zhì);配后要及時(shí)滅菌。

　　實(shí)驗原理：

　　培養基是人工按一定比例配制的供微生物生長(cháng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養物質(zhì)的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)因素、能源和水。根據微生物的種類(lèi)和實(shí)驗目的不同，培養基要選擇合適的配比關(guān)系;選擇合適的理化性質(zhì);配后要及時(shí)滅菌。

　　牛肉膏蛋白胨培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時(shí)又稱(chēng)為普通培養基。由于這種培養基中含有一般細胞生長(cháng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養物質(zhì)，所以可供細菌生長(cháng)繁殖之用。

　　高壓蒸汽滅菌方法主要是通過(guò)升溫使蛋白質(zhì)變性從而達到殺死微生物的效果。

　　從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：?jiǎn)渭毎�挑取法，稀釋涂布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線(xiàn)法等。

　　實(shí)驗內容：

　　1.牛肉膏蛋白胨培養基的制備

　　(1)計算 根據配方計算出實(shí)驗中各種藥品所需要的量，然后再分別稱(chēng)量。

　　(2)稱(chēng)量 準確稱(chēng)取各種成分。一些不易稱(chēng)量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸紙上稱(chēng)量，然后連同硫酸紙一起放入燒杯中。

　　(3)溶解 向燒杯內加入所需的水量，將牛肉膏用水洗下后，取出硫酸紙棄去。加熱攪拌全溶后稍放冷。

　　(4)調pH值 用酸度計或精密pH試紙測定其pH值，并用10%NaOH調至所需pH值，必要時(shí)用濾紙或脫脂棉過(guò)濾。一般比要求的pH高出0.2，因為高壓蒸汽滅菌后，pH常降低。

　　(5)分裝 根據不同需要，可將配好的培養基分裝入配有棉塞的試管或三角瓶?jì)�。注意分裝時(shí)避免培養基掛在瓶口或管口上引起雜菌污染。如液體培養基，應裝試管高度的1/4左右;固體培養基裝試管高度的1/5左右;裝入三角瓶的量以三角瓶容量的一半為限。

　　(6)包扎 試管扎成捆。試管和三角瓶的棉塞外用硫酸紙和牛皮紙包扎，紙上表明培養基的名稱(chēng)、配制日期等。

　　(7)滅菌 培養基用0.1Mpa(15lb/in2)高壓蒸汽滅菌15~20min。

　　2.培養基的高壓蒸汽滅菌

　　滅菌原理：水的沸點(diǎn)可隨壓力的增加而提高，當高壓蒸汽滅菌鍋中水煮沸時(shí)，因鍋是密閉的，蒸汽不能溢出，而使壓力增加，水的沸點(diǎn)和溫度也隨之增加。因此，高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽產(chǎn)生的高溫，以及熱蒸汽的穿透能力來(lái)達到滅菌的目的。一般在0.1Mpa(15lb/in2)的壓力時(shí)，溫度可達121℃只要維持15~20min，就可殺死一切微生物的營(yíng)養體和它們的各種孢子。

　　滅菌方法：

　　(1)加水于滅菌器內到規定的水平面。

　　(2)需滅菌的物品(分裝在試管、三角燒瓶中的固、液體培養基)，棉塞、硅膠泡沫塞等用防潮紙包好(防止鍋內水汽把棉塞淋濕)，放入滅菌鍋內的套筒中。擺放要疏松，不可太擠，否則阻礙蒸汽流通，影響滅菌效果。

　　(3)將滅菌鍋蓋的排氣管插人套筒側壁的凹槽內，關(guān)閉滅菌鍋蓋旋緊螺栓，切勿漏氣。

　　(4)打開(kāi)放氣閥，加熱，熱蒸汽上升，以排除鍋內冷空氣，排氣約5~ l0min，關(guān)閉放氣閥。

　　(5)關(guān)閉放氣閥后，整個(gè)滅菌鍋成為密閉狀態(tài)，而蒸汽又不斷增多，這時(shí)壓力和溫度都上升，直至壓力表指針達到所需壓力時(shí)，開(kāi)始計時(shí)，通過(guò)調節熱源，維持此壓力到所需時(shí)間。

　　(6)滅菌完畢，待壓力自然降至0時(shí)，打開(kāi)放氣閥，注意不能打開(kāi)過(guò)早，否則突然降壓致使培養基沖騰，使棉塞、硅膠泡沫塞沾污，甚至沖出容器以外。

　　(7)打開(kāi)滅菌鍋蓋，取出已滅菌的器皿及培養基。

　　(8)滅菌鍋用完后，將鍋內剩余的水倒掉，以免日久腐蝕。

　　3.微生物的分離與純化

　　借助于劃線(xiàn)將混雜的細菌材料逐步稀釋?zhuān)�最后在瓊脂平板上分散開(kāi)來(lái)，使之出現單一菌落而達到分離純化的目的。

　　4. 注意事項

　　1.要嚴格按配方配制。

　　2.調pH不要過(guò)頭。

　　3.高壓滅菌要注意物品不要過(guò)多，加熱后排除冷空氣，到時(shí)降壓回零取物。

　　4. 劃線(xiàn)法分離純化微生物注意各區勿相互交叉。