細胞爬片的制作方法

　　爬片的準備

　　1. 爬片可用一般的蓋玻片，也可用專(zhuān)用爬片;

　　2. 應用蓋玻片，可根據自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于 6 孔板、12 孔板或 24 孔板;裁剪時(shí)可用前護士輸液用于打開(kāi)玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開(kāi)了。 如果接種大皿的話(huà)，我一般不將蓋玻片切開(kāi)，直接清潔后放入培養皿中，到染色時(shí)再將之切 開(kāi)，這樣既保證了細胞均一性，又可同時(shí)做幾個(gè)指標的染色。

　　3. 將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過(guò)夜，第二天先用自來(lái)水沖洗 20 遍，再置于無(wú) 水酒清中浸泡 6 小時(shí)，再用三蒸水沖洗 3 遍(個(gè)人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話(huà)，細胞帖壁不好)，放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

　　4. 高壓后取出放入烤箱中烤干，備用�？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。

　　5. 關(guān)于多聚賴(lài)氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時(shí)從來(lái)沒(méi)用過(guò)多聚賴(lài)氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續的免疫細胞化學(xué)染色、TUNEL 等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過(guò)片。

　　【細胞爬片】

　　1. 胰酶消化細胞后計數重懸細胞于完全培養基中。

　　2. 加細胞時(shí)，根據玻片的大小，先在每個(gè)孔里準備放爬片的位置滴少量培養基，目的是使 玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時(shí)玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。

　　3. 根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養板內即可 4. 待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養基。

　　5. 按照實(shí)驗設計，作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出 就可以了。如果要做諸如 24h，48h，72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗的話(huà)，將所需數量的爬片取出時(shí)應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著(zhù)繼續培養。

　　【細胞爬片的固定】 細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當然，根據研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過(guò)程中有可能會(huì ) 脫落。另外在保存細胞爬片的時(shí)候，我一般用培養皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實(shí)驗時(shí)取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記，為避免混淆，可用透明膠 帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存 2-3 個(gè)月的片子做免疫組化是沒(méi)有問(wèn)題的。

　　以下為常用的固定液

　　1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。將純的丙酮預先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心，丙酮在此溫度不會(huì )為固體的)細胞爬 片取出后，PBS洗 2 遍，便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強的揮發(fā)性，注意將含有丙酮 和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發(fā))固定 10 分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

　　2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類(lèi)淋巴細胸分化決定簇 (CD)、主要組織相容性抗原等 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存。

　　3. 95%乙醇，可用于免疫組化。

　　優(yōu)點(diǎn)：穿透性強、抗原性保存較好。 缺點(diǎn)：但醇類(lèi)對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕， 固定后可再溶解;染色過(guò)程中，溫育時(shí)間長(cháng)，抗原可流失而減弱反應強度 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

　　4. 甲醛(福爾馬林)應用最廣 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結構保存好，且穿透性強， 缺點(diǎn)： 甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露�？稍斐杉訇幮缘娜旧�結果。 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存 。