細胞因子的檢測方法

　　細胞因子檢測方法綜述：

　　細胞因子(cytokine)是由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質(zhì)的統稱(chēng)[1]。在免疫應答過(guò)程中，細胞因子在免疫調節、炎癥應答、腫瘤轉移等生理和病理過(guò)程中起重要作用。細胞因子的檢測不僅是基礎免疫研究的有較手段，同時(shí)在臨床疾病診斷、病程觀(guān)察、療效判斷及細胞因子治療監測方面具有重要價(jià)值。

　　但是，由于細胞因子在體內的含量甚微，給細胞因子的檢測帶來(lái)困維，細胞因子的檢測尚未在臨床診斷上廣泛開(kāi)展，已知目前采用的細胞因子檢測方法均不完善，且不同的檢測方法所得的結果差異較大，給臨床診斷與治療帶來(lái)一定的困難。因此，有必要了解各種檢測方法的特性及影響因素[2]。

　　目前，細胞因子生物學(xué)活性檢測和濃度測定方法主要有以下幾類(lèi)。

　　一.生物學(xué)檢測法

　　生物學(xué)檢測又稱(chēng)生物活性檢測，是根據細胞因子特定的生物活性而設計的檢測法。由于各種細胞因子具有不同的活性，例如IL-2促進(jìn)淋巴細胞增殖，TNF殺傷腫瘤細胞，CSF刺激造血細胞集落形成，IFN保護細胞免受病毒攻擊，因此選擇某一細胞因子獨特的生物活性，即可對其進(jìn)行檢測[2]。生物活性檢測法又可分為以下幾類(lèi)：

　　1.細胞增殖法

　　許多細胞因子具有細胞生長(cháng)因子活性，特別是白細胞介素，如IL-2刺激t細胞生長(cháng)、IL-3刺激肥大細胞生長(cháng)、IL-6刺激漿細胞生長(cháng)等。利用這一特性，現已篩選出一些對特定細胞因子起反應的細胞，并建立了只依賴(lài)于某種因子的細胞系，即依賴(lài)細胞株(簡(jiǎn)稱(chēng)依賴(lài)株)。這些依賴(lài)株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴(lài)株ctll-2在不含IL-2的培養基中很快死亡，而加入IL-2后則可右體外長(cháng)期培養。在一定濃度范圍內，細胞增殖與IL-2量呈正比，因此通過(guò)測定細胞增殖情況(如使用3h-tdr摻入法、MTT法等)鑒定IL-2的含量。除依賴(lài)株外，還有一些短期培養的細胞，如胸腺細胞、骨髓細胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細胞等，均可作為靶細胞來(lái)測定某種細胞因子活性。

　　2.靶細胞殺傷法

　　是根據某些細胞因子(如TNF)能在體外殺傷靶細胞而設計的檢測方法。通常靶細胞多選擇體外長(cháng)期傳代的腫瘤細胞株，利用同位素釋放法或染料染色等方法判定細胞的殺傷率。

　　3.細胞因子誘導的產(chǎn)物分析法

　　某些細胞因子可刺激特定細胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2、IL-3誘導骨髓細胞合成胺、IL-6誘導肝細胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通過(guò)測定所誘生的相應產(chǎn)物，可反映細胞因子的活性。

　　4.細胞病變抑制法

　　病毒可造成靶細胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導致的細胞病變，因此可利用細胞病變抑制法檢測這類(lèi)因子。

　　二、免疫學(xué)檢測法

　　細胞因子均為蛋白或多肽，具有較強的抗原性。隨著(zhù)重組細胞因子的出現，可較方便地獲得細胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此可利用抗原抗體特異性反應的特性，用免疫學(xué)技術(shù)定量檢測細胞因子。盡管細胞因子種類(lèi)繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體(包括多克隆抗體或單克隆抗體)均可采用相似的技術(shù)開(kāi)展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印跡法。目前，幾乎所有常見(jiàn)細胞因子的檢測試劑盒均有商品供應。此外還可利用酶標或熒光標記的抗細胞因子單克隆抗體，原位檢測因子在細胞內的合成及分布情況，如近來(lái)來(lái)發(fā)展起來(lái)的細胞內染色法和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)等。免疫學(xué)檢測法可直接測定樣品中特定細胞因子的含量(用ng/ml表示)，為大規模檢測臨床病人血清中細胞因子的含量提供了方便。本法僅測定細胞因子的抗原性，與該因子活性不一定相平行，因此要了解細胞因子的生物學(xué)效應，必須結合生物學(xué)檢測法。

　　三、分子生物學(xué)方法

　　這是一類(lèi)利用細胞因子的基因探針檢測特定細胞因子基因表達的技術(shù)。目前所有公認的細胞因子的基因均已克隆化，故能較容易地得到某一細胞因子的cDNA探針或根據已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測細胞因子mRNA表達的方法多種多樣，常使用斑點(diǎn)雜交、Northern blot、逆轉錄PCR，細胞或組織原位雜交等。實(shí)驗的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的核酸探針和獲得合格的待測物(提取的mRNA樣品或細胞/組織標本)。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標記物(如生物素、地高辛等)標記并與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA、RNA。根據其來(lái)源可分為cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點(diǎn)雜交及Northern blot，而RNA探針因穿透性好更適用于原位雜交。核酸探針技術(shù)的應用已經(jīng)程序化，以cDNA探針為例主要包括：①質(zhì)粒DNA的提取;②靶DNA片段的分離;③靶DNA片段標記;④待測樣品mrna的提取;⑤標記cDNA探針對待檢樣品的雜交;⑥放射自顯影或顯色分析。近年來(lái)出現的RT-PCR檢測特異性mRNA的方法也廣泛用于細胞因子研究領(lǐng)域。該法具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，甚至從1～10個(gè)細胞中就可檢出其中的特異mRNA。

　　上述三種方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，可互相彌補，在實(shí)際應用中，可根據各自的實(shí)驗目的和實(shí)驗室條件進(jìn)行選擇。生物學(xué)檢測法比較敏感，又可直接測定生物學(xué)功能，是最可靠的方法，適用于各種實(shí)驗目的，是科研部門(mén)最常用的技術(shù)，但需要長(cháng)期培養依賴(lài)性細胞株，檢測耗時(shí)長(cháng)，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。免疫學(xué)檢測法比較簡(jiǎn)單，迅速，重復性好，但所測定的只代表相應細胞因子的量而不代表活性，同時(shí)敏感度也低于生物活性檢測法(約低10～100倍)。分子生物學(xué)法只能檢測基因表達情況，不能直接提供有關(guān)因子的濃度及活性等資料，主要用于機制探討。在檢測細胞因子時(shí)，必須考慮到細胞因子的作用具有網(wǎng)絡(luò )性的特點(diǎn)，人們需明確檢測方法所測定的細胞因子成分，并考慮其抑制劑和可溶性受體的水平，將各種結合使用，有可能得到較為可靠的結果。