免疫磁珠方法分選細胞步驟

　　用免疫磁珠做細胞分選(MACS)是高效簡(jiǎn)捷的免疫細胞及其它細胞的分離純化方法。 原理是已包被一抗的磁珠與細胞表面相應分子特異性結合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預先已與細胞表面分子特異結合的一抗結合。磁珠攜帶與之結合的細胞吸附于分離柱/試管上，實(shí)現…

　　用免疫磁珠做細胞分選(MACS)是高效簡(jiǎn)捷的免疫細胞及其它細胞的分離純化方法。

　　原理是已包被一抗的磁珠與細胞表面相應分子特異性結合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預先已與細胞表面分子特異結合的一抗結合。磁珠攜帶與之結合的細胞吸附于分離柱/試管上，實(shí)現陽(yáng)性細胞分離或陰性細胞的分離。本節介紹超微磁珠間接標記、用分離柱陽(yáng)性分選細胞的方法。

　　Protocal：

　　1.離心收集待分離細胞，用少量PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA PH7.2 PBS，真空抽濾除菌及液體內氣體)充分混懸細胞(0.5ml/1×108細胞)，加入一抗(10~20μg/ml終濃度)，4° C孵育30分鐘。

　　2.用20倍體積PBE洗細胞一次，再加PBE(0.3ml/1×108細胞)充分混懸細胞后，加入相應二抗包被的超微磁珠，混勻后置8~15° C孵育10~15分鐘。

　　3.將分離柱安裝入磁場(chǎng)中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流盡，以預處理分離柱。

　　1.如果分離細胞用作培養，全過(guò)程在超凈臺中完成。

　　2.超微磁珠及微小磁場(chǎng)系統適合于少量細胞分離(如106-107)，通常已適用于大多數實(shí)驗研究;此外各公司尚有大磁珠及大磁場(chǎng)供應，可用于更大量細胞的分選;除分離柱外，也有試管及其它設備用于分選;根據我們應用的經(jīng)驗，分離柱由于提供了較大的接觸面，在細胞分選上具有較多優(yōu)點(diǎn)。磁場(chǎng)也可以自制，用一般的磁鐵即可做成簡(jiǎn)易磁場(chǎng)，可提供足夠的磁力。

　　3.磁珠分離系統分離的細胞純度可以達到80~99%，得率在60~90%左右，僅次或相當于流式細胞儀(FACS)的分選效率，與FACS 相比，MACS設備簡(jiǎn)單，耗時(shí)極短，故而應用廣泛。MACS也可用做FACS分選前的預分離，以減少FACS所用時(shí)間。另外連續兩次過(guò)柱分選可進(jìn)一步提高分選細胞純度，通�？蛇_95-99%。

　　4.在分離柱尾接上限速針頭，收集的首次流下的細胞即為陰性選擇細胞，一般純度低于陽(yáng)性選擇。

　　5.分離柱一般只能一次應用，再用時(shí)降低分離效率;

　　6.分選下的細胞可用熒光標記抗體(一抗或二抗)標記后FACS鑒定純度;我們用熒光抗體直接標記細胞后，用二抗包被磁珠分選出細胞，直接做FACS分析，也可實(shí)現分選和純度檢測。

　　7.陽(yáng)性選擇后，如需用第二種表面標志繼續分離，可以用剪切酶剪切下之結合的磁珠和一抗，再次進(jìn)行下一輪分選。如需進(jìn)行細胞功能分析，也可經(jīng)培養12~24小時(shí)，使結合的磁珠脫落后進(jìn)一步使用陽(yáng)選的細胞做研究。

　　分選的效率在很大程度上取決于實(shí)驗者對關(guān)鍵環(huán)節的把握。我們建議實(shí)驗者在操作前認真閱讀相應的說(shuō)明書(shū)及以下特別值得提出引起重視的有以下幾點(diǎn)：

　　1.待分選細胞中如有貼壁細胞，建議在分選前先貼壁培養去除，或者提高EDTA濃度;

　　2.抗體包被磁珠對死細胞常有非特異性結合。因而分選前去除死細胞;

　　3.新鮮分離骨髓細胞，先用膠原酶、DNA酶、胰酶聯(lián)合消化，可使細胞團塊解聚，從而提高分離效率。

　　4.上分離柱前，充分振蕩，混懸細胞，打散細胞團塊;

　　5.用分離柱分選，應用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯;

　　6.細胞懸液加入分離柱中時(shí)，應將滴管伸至底壁后加入，避免將細懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細胞，以致后繼洗柱過(guò)程中，因疏忽末被洗下，最后導致純度不高。洗柱時(shí)，應在前次液體充分流盡后，再加洗液。

　　7.分選細胞量應根據說(shuō)明書(shū)控制，不超量;

　　8.孵育時(shí)間和溫度應按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，延長(cháng)孵育時(shí)間、提高溫度會(huì )增加非特異結合;

　　9.先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結合;