流式細胞實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題解答

　　流式細胞實(shí)驗的對照應該如何設置?什么是同型對照?

　　答：①在應用流式技術(shù)檢測細胞表面抗原時(shí)，我們通常要設的一個(gè)對照就是同型對照。

　　同型對照：使用與熒光標記抗體相同來(lái)源、相同標記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色。

　�、诩毎�因子的流式檢測時(shí)，由于細胞經(jīng)過(guò)了培養刺激活化的處理，為保證測得結果的準確性和客觀(guān)性，除了同型對照外，還需另設置未刺激對照和刺激對照。

　　未刺激對照：激活時(shí)由于BFA等的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過(guò)程中產(chǎn)生的抗原與細胞因子會(huì )滯留胞內，未刺激對照也應包含BFA等阻斷劑。

　　激活對照：激活對照使用細胞表面表達CD69來(lái)評價(jià)激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問(wèn)題，某一試劑可能失活，過(guò)期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實(shí)驗。

　　間接免疫熒光標記法如何設置同型對照?

　　答：同型對照的目的是消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色，而確保檢測結果的真實(shí)性。在采用間接免疫熒光標記法流式檢測時(shí)，所設的同型對照是與一抗相同劑量、相同亞型和相同生物素標記(或純化)免疫球蛋白，之后的熒光標記過(guò)程與實(shí)驗檢測組相同即可。

　　為什么流式細胞術(shù)多色分析時(shí)要進(jìn)行熒光補償調整?

　　答：在進(jìn)行流式細胞術(shù)多色分析時(shí),待測細胞通常攜帶兩種或兩種以上的熒光素,如異硫氰熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、別藻紅蛋白(PECY5)等。這些熒光素被激光激發(fā)后發(fā)出不同波長(cháng)的熒光,理論上每一種熒光通過(guò)選擇恰當的濾光片可被相應的檢測器檢測到,而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發(fā)射譜性質(zhì),盡管它們的發(fā)射峰各不相同,但發(fā)射譜范圍有一定的重疊,也就是說(shuō),相鄰的檢測器會(huì )檢測到彼此的熒光信號,例如,FITC檢測器會(huì )檢測到少量的PE光譜,而PE檢測器會(huì )檢測到較多的FITC光譜。這樣就影響了檢測結果的準確性,因此,多色分析時(shí)必須進(jìn)行光譜重疊的校正。

　　如何檢測胞內因子抗體的特異性?

　　答：可以應用過(guò)量的相應細胞因子先封閉該胞內因子的熒光標記抗體，或者先用不帶熒光標記的相應因子抗體先封閉細胞，進(jìn)一步流式操作作對照;另外同型對照也可以判斷細胞的固定、破膜的效果以及非特異性背景的影響。

　　為什么用CD45αSSC設門(mén)法進(jìn)行流式細胞術(shù)白血病表型分析?

　　答:免疫分型所用的樣本通常是骨髓,由于骨髓中各種大小和分化程度的細胞均有,只根據細胞大小和顆粒密度很難將不同組分的細胞區分開(kāi)。而造血系統細胞的CD45表達的熒光強度(FI)與細胞分化程度有一定關(guān)系,即分化程度高的成熟白細胞其CD45的FI也高,分化程度低的細胞其FI也低,而紅系細胞的FI最低。在成熟白細胞中,各類(lèi)細胞其CD45的FI亦不相同,其中淋巴細胞和單核細胞的FI高于中性粒細胞。因此,根據各類(lèi)細胞CD45的FI和顆粒密度不同,采用CD452SSC(側向角散射)設門(mén)法可以將原始細胞(低FI,低或高SSC)、淋巴細胞(高FI,低SSC)、單核細胞(高FI,中等SSC)、中性粒細胞(低FI,高SSC)、紅系細胞(最低FI,低或高SSC)和細胞碎片(最低FI,最低SSC)清楚地區分開(kāi)。