植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對策

　　從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。要進(jìn)行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學(xué)研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在。

　　從文獻報道上看，有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA， 而阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進(jìn)展。一般認為在這些植物組織中，或富含酚類(lèi)化合物，或富含多糖，或含有某些尚無(wú)法確定的次級代謝產(chǎn)物，或RNase的活性較高。在完整的細胞內這些物質(zhì)在空間上與核酸是分離的，但當組織被研磨，細胞破碎后，這些物質(zhì)就會(huì )與RNA相互作用。酚類(lèi)化合物被氧化后會(huì )與RNA不可逆地結合，導致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時(shí)RNA的丟失，或形成不溶性復合物;而多糖會(huì )形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來(lái);萜類(lèi)化合物和RNase會(huì )分別造成RNA的化學(xué)降解和酶解。對于這些植物材料，用常規的RNA提取方法(如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等)難以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常規的方法提取芒果果實(shí)的RNA時(shí)未能成功，他們的結果分為三種情況：提出的RNA已被降解;RNA的得率很低;得到的RNA不能進(jìn)行體外翻譯。他們認為在果實(shí)成熟時(shí)各種酶的活性增強，其中也包含RNase，不溶性的淀粉轉化為可溶性的多糖，芒果果實(shí)細胞壁中特殊的成份，以及果實(shí)中高含量的多酚化合物都是干擾RNA提取的因素。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果實(shí)的RNA時(shí)，發(fā)現RNA與某種未知化合物凝聚成不溶性的復合物，并且這種未知化合物在230nm和270nm處有強的光吸收，從而干擾了RNA紫外吸收的測定。因此能否有效地去除多糖、酚類(lèi)化合物、RNase和干擾RNA提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物RNA成敗的關(guān)鍵。本文根據文獻綜述了解決上述植物RNA提取過(guò)程中難點(diǎn)的相應對策。

　　1. 酚類(lèi)化合物的干擾及對策

　　許多植物組織特別是植物的果實(shí)(如蘋(píng)果、櫻桃、李子、葡萄等)和樹(shù)木類(lèi)植物中富含酚類(lèi)化合物。酚類(lèi)物質(zhì)的含量會(huì )隨著(zhù)植物的生長(cháng)而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類(lèi)植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時(shí)，酚類(lèi)物質(zhì)會(huì )釋放出來(lái)，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚�，并隨氧化程度的增加而加深，這一現象被稱(chēng)為褐化效應(browning effect)。被氧化的酚類(lèi)化合物(如醌類(lèi))能與RNA穩定地結合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現RNA提取的難易程度與材料中酚類(lèi)物質(zhì)的總量之間并無(wú)相關(guān)性，因此認為不是所有的酚類(lèi)化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類(lèi)物質(zhì)(如原花色素類(lèi)物質(zhì))是影響RNA提取的一類(lèi)化合物。目前去除酚類(lèi)化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開(kāi)。

　　1.1 防止酚類(lèi)化合物被氧化的方法

　　還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)或半胱氨酸來(lái)防止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化，有時(shí)提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2%。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過(guò)夜沉淀RNA時(shí)加入(-巰基乙醇(終濃度1%)可以防止在此過(guò)程中酚類(lèi)化合物的氧化。硼氫化鈉(NaBH4)是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類(lèi)化合物可被還原成多酚化合物。

　　螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中的CO-N=基有很強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨著(zhù)多酚化合物中芳環(huán)羥基數量的增加而加強。原花色素類(lèi)物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩定的復合物，使原花色素類(lèi)物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在pH8.0以上時(shí)PVP結合多酚的能力會(huì )迅速降低。當原花色素類(lèi)物質(zhì)量較大時(shí)，單獨使用PVPP無(wú)法去除所有的這類(lèi)化合物，因而需要與其它方法結合使用。

　　Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸(pH7.5)，其中的硼酸可以與酚類(lèi)化合物依靠氫鍵形成復合物，從而抑制了酚類(lèi)物質(zhì)的氧化及其與RNA的結合。這一方法十分有效，所以L(fǎng)бpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過(guò)高(>0.2M)則會(huì )影響RNA的回收率。

　　牛血清白蛋白(BSA)法：原花色素類(lèi)物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類(lèi)似于抗原-抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復合物，減小了原花色素類(lèi)物質(zhì)與RNA結合的機會(huì )，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結合使用提取效果會(huì )更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。

　　丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹(shù)、山毛櫸等富含酚類(lèi)化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。

　　Guillemant等和Ainsworth認為低pH值(pH5.5)的提取緩沖液可以防止酚類(lèi)化合物的離子化和進(jìn)一步的氧化。

　　1.2 酚類(lèi)化合物的去除

　　通過(guò)Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類(lèi)化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結合的多酚，可以直接通過(guò)離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇(50%)來(lái)沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50% 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無(wú)需再用NaBH4來(lái)處理。

　　2. 多糖的干擾及對策

　　多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問(wèn)題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開(kāi)。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少;而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規的方法中，通過(guò)SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖;在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖;通過(guò)LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過(guò)這些步驟仍會(huì )發(fā)現有相當多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來(lái)解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問(wèn)題。

　　用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無(wú)水乙醇至終濃度10%~30%，可以使多糖沉淀下來(lái)，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10%以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30%乙醇來(lái)沉淀多糖的，進(jìn)一步純化了RNA樣品。

　　另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀(pH4.8)溶液以沉淀多糖;Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀(pH4.8)溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀(pH6.5)溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時(shí)，是將上述兩種方法結合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入0.25體積的無(wú)水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨使用乙醇或醋酸鉀都無(wú)效，只有兩者結合使用效果最佳。

　　Fang等認為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹(shù)RNA時(shí)，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過(guò)氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋?zhuān)�調節Na+離子濃度至80mM，然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來(lái)沉淀去除多糖。

　　3. 蛋白雜質(zhì)的影響及對策

　　蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性;提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚;有的方法是利用蛋白酶K來(lái)降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。

　　Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70%高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。接著(zhù)在離心上清液中加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，這時(shí)RNA能沉淀下來(lái)而能溶于70%高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。

　　4. 次級代謝產(chǎn)物的影響及對策

　　從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結合并與RNA共同被抽提出來(lái)而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒(méi)有什么特殊的方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹(shù)種子、成熟松樹(shù)針葉等植物組織的RNA。

　　由于植物組織特別是高等植物組織細胞內外組成成分的復雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來(lái)說(shuō)要困難的多。實(shí)踐中經(jīng)常會(huì )發(fā)現，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會(huì )有很大的不同;含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同;即使是同一種植物同一種組織材料，但來(lái)源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對于某一植物或其組織來(lái)說(shuō)，其相應的RNA提取方法必需經(jīng)過(guò)摸索和實(shí)踐才能確立。

　　隨著(zhù)植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說(shuō)，在作為其研究基礎的植物材料RNA提取過(guò)程中還會(huì )出現新的難點(diǎn)，但隨著(zhù)不斷地探索和經(jīng)驗的積累，科學(xué)工作者們一定會(huì )迅速地解決這些難點(diǎn)，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。