免疫沉淀的改進(jìn)方法

　　免疫沉淀是研究蛋白質(zhì)常用的技術(shù)，是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法�？贵w與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復合物，沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

　　如果蛋白樣品在孵育抗體前未經(jīng)珠子預處理，會(huì )導致一些非特異蛋白與ProteinA/G結合，從而干擾試驗結果。另外如果同時(shí)加入抗體和珠子，有時(shí)會(huì )出現沉淀效率不高的情況。

　　方法改進(jìn)：

　　1、預處理：在加入抗體和珠子之前，加入20-30微升50%濃度的珠子懸浮液于蛋白裂解液中，4度搖床孵育一個(gè)小時(shí)。對于經(jīng)常做IP或者CO-IP的實(shí)驗室，可以將同一種樣品第一次預處理所用的珠子收集起來(lái)置于四度保存，以備下次沉淀同樣蛋白裂解液時(shí)預處理用。

　　2、抗體，珠子分別孵育。先將適量抗體加入蛋白裂解液中，4度搖床孵育過(guò)夜。然后加入適量珠子，4度搖床孵育2到3個(gè)小時(shí)。