蛋白質(zhì)比色定量方法

　　傳統標準的BCA 蛋白定量分析方法常規均使用試管或者微孔板進(jìn)行檢測，通過(guò)對傳統方法進(jìn)行改進(jìn)，可使用Take3™ 超微量檢測板進(jìn)行原位微量BCA法蛋白定量分析。待測蛋白樣品和BCA 工作緩沖液按照順序直接加在Take3™板的微量定量孔處、溫浴，使用Epoch™ 微孔板分光光度計進(jìn)行檢測。和傳統標準BCA 方法(BCA 工作緩沖液和蛋白質(zhì)樣品體積比為20：1)相比，該方法的蛋白檢測靈敏度有明顯的提高。相比Mini-BCA 分析法，該分析方法更加精確。

　　BCA 法是十分常用的蛋白質(zhì)比色定量方法，很多試劑供應商都提供基于比色皿和微孔板的BCA 蛋白定量試劑盒。BCA蛋白定量法相對于其它比色定量法具有操作簡(jiǎn)單、穩定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。相對于蛋白質(zhì)固有的280nm 吸收峰檢測，BCA 檢測法提高了蛋白檢測靈敏度和特異性，消除了核酸的干擾，核酸干擾在對細胞裂解物或其他生物樣品進(jìn)行蛋白定量時(shí)總是一個(gè)難以避免的干擾。在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+, Cu+ 與BCA 試劑形成紫色絡(luò )合物，如圖1. 其吸光值與蛋白濃度成正比。測定在562nm 處的吸收值，并與標準曲線(xiàn)對比，即可計算待測蛋白的濃度。

　　材料和方法

　　BCA 檢測試劑盒及小牛血清 (BSA) 。我們使用兩種實(shí)驗方法來(lái)進(jìn)行BCA 檢測。

　　第一種方法是按照NanoDrop 技術(shù)手冊推薦的“Mini-BCA”法。其簡(jiǎn)要流程是：BCA 檢測系統混合好的10uL BCA 工作緩沖液和10uL 的標準蛋白或待測的10uL 樣品(1：1)在試管中混勻，37℃溫浴30 分鐘后進(jìn)行檢測。

　　第二種方法是使用Take3超微量多體積檢測板進(jìn)行原位檢測。其簡(jiǎn)要流程是：直接按照順序滴加2uL 標準蛋白或樣品，然后再滴加2uL BCA 工作緩沖液到Take3 板的檢測孔上，標準蛋白和檢測樣品每個(gè)2 份，室溫(~22℃)孵育25 分鐘后進(jìn)行樣品的定量檢測。

　　所有DNA 檢測均使用空白矯正。信噪比(S/N)通過(guò)每孔平均熒光信號的標準差扣掉空白值來(lái)確定。標準曲線(xiàn)采用線(xiàn)性回歸方程。

　　板布局給出BSA 標準蛋白的位置和濃度以及多達四個(gè)未知濃度標準品。這個(gè)布局提供了6個(gè)標準蛋白濃度點(diǎn)用于制作標準曲線(xiàn)，這6個(gè)點(diǎn)位于A(yíng)-F行，每個(gè)點(diǎn)有兩個(gè)重復，濃度范圍為0.01-1.0mg/mL，還有4 個(gè)檢測孔用于放置未知樣品，位于G、H 行。原位BCA 法和Mini-BCA 法都是用這種布局，來(lái)比較試驗的準確性。

　　空白對照是1：1 體積的BCA 工作緩沖液和去離子水。BCA法蛋白定量的檢測波長(cháng)為562nm。BSA 的實(shí)際濃度是使用Take3 和1cm 標準光程的BioCell 石英比色杯在Epoch 分光光度計上檢測得到的。