細胞培養基本要點(diǎn)

　　細胞培養基本要點(diǎn)

　　(一)準備和安裝過(guò)濾器　(二)合成培養基的配制　(三)小牛血清的處理　(四)生長(cháng)培養基的配制

　　(五)凍存細胞的復蘇　　(六)傳代　　　　　　　(七)凍存　　　　　　(八)注意事項

　　(一)準備和安裝過(guò)濾器

　　清洗好過(guò)濾器，干燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進(jìn)行高壓滅菌處理。 在超凈臺內打開(kāi)過(guò)濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過(guò)濾，過(guò)濾后要檢查濾膜是否完好無(wú)損。

　　(二)合成培養基的配制

　　1、根據細胞目錄中的說(shuō)明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養基干粉，用適量超純水充分溶解。

　　2、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分攪拌使之溶解。

　　3、 調 pH至7.2左右。

　　4、 加水至最終體積。

　　5、 在超凈臺中對溶液進(jìn)行濾過(guò)除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。

　　6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。

　　(三)小牛血清的處理

　　市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補體(近來(lái)也有觀(guān)點(diǎn)認為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。

　　1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。

　　2、 處理后的血清貯存于4℃。

　　3、 小牛血清在使用前最好進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。

　　(四)生長(cháng)培養基的配制

　　除無(wú)血清培養之外，各種合成培養基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。

　　培養基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。

　　按如下比例配制： 基本培養基占80%~90%，小牛血清或胎牛血清占10%~20%。 按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL，。

　　(五)凍存細胞的復蘇

　　應遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37。5度，取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。

　　在無(wú)菌臺內將完全培養基加入50ml的小培養瓶?jì)�，約5ml左右，然后用無(wú)菌吸管從凍存管內取出細胞，置培養并內輕輕搖晃，使細胞均勻后置培養箱內培養。

　　(六)傳代:

　　貼壁細胞:

　　對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強度減弱(或PBS洗1-3次)。50ml培養瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進(jìn)行消化，(根據經(jīng)驗)，晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養箱約2-5分鐘，鏡下見(jiàn)細胞收縮變圓或少數脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養瓶?jì)�，加入完全培養基后繼續培養或實(shí)驗。

　　懸浮細胞:

　　一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶?jì)�，加入完全培養基繼續培養，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入完全培養基，輕輕吹勻后，分置其它培養瓶?jì)燃尤胪耆�培養基繼續培養。

　　(七)凍存

　　將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以完全培養基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。

　　(八)注意事項

　　玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時(shí)以上;

　　無(wú)菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線(xiàn)照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時(shí)以上;

　　培養基(pH7.2)和血清配制好后要做無(wú)菌試驗:將血清按10%加入培養基內，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天，肉眼見(jiàn)無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;

　　消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成支置-20度保存;

　　培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線(xiàn)的應照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應按程序來(lái)菌)。至少每月一次。

　　進(jìn)入操作時(shí)應注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往，如果數量較多，培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離，開(kāi)瓶(蓋)時(shí)應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒，打開(kāi)后應用燈先燒口，然后燒蓋。用完后同樣操作。整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺靠里面一點(diǎn)。