細胞培養過(guò)程有哪些污染及怎樣減少污染

　　細胞培養中的污染分為兩類(lèi)，化學(xué)污染和生物污染。

　　化學(xué)污染

　　化學(xué)污染是一些對細胞有毒性的或對細胞產(chǎn)生刺激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來(lái)自于沒(méi)有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。

　　化學(xué)污染中比較引人注意的是細菌內毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強的物質(zhì)有很強的吸附能力。細菌內毒素可刺激部分細胞產(chǎn)生一些激素或細胞因子，對細胞生長(cháng)和實(shí)驗結果產(chǎn)生影響。細菌內毒素是臨床上的最主要的熱原(即注射到動(dòng)物體內會(huì )導致動(dòng)物發(fā)熱)，所以通過(guò)細胞培養生產(chǎn)的疫苗、細胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過(guò)程中更是要避免細菌內毒素的污染。

　　生物污染

　　生物污染包括比較容易發(fā)現的細菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現的病毒、支原體和其他細胞的污染。

　　細菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非�？焖俚纳�長(cháng)。這些污染比較容易觀(guān)察到，它們往往會(huì )使其污染的培養液產(chǎn)生可見(jiàn)的變化，或者通過(guò)顯微鏡觀(guān)察就可以看見(jiàn)。

　　· 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現，因為病毒顆粒特別微小，一般的實(shí)驗室都沒(méi)能力檢查細胞培養中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內，對整個(gè)細胞培養不是致死的，所以它可能會(huì )使研究人員長(cháng)期得到受病毒影響的細胞的實(shí)驗結果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現細胞培養中的支原體污染。90年代初美國的一個(gè)調查發(fā)現，在該國的細胞培養中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒(méi)有細胞壁，在細胞培養液中幾乎是透明的，同時(shí)對常用于細胞培養中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現，但是其存在會(huì )影響實(shí)驗的結果。

　　細胞的交叉污染在細胞培養中發(fā)生的嚴重程度大大超過(guò)人們的想象：1981 年對ATCC細胞株的調查顯示：超過(guò) 60 標記為其他細胞株的細胞居然是 HeLa 細胞。

　　怎么樣才能減少污染的機會(huì )?

　　減少化學(xué)污染

　　對于自己用粉末配制培養液的實(shí)驗室來(lái)說(shuō)，配制培養液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機會(huì )。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過(guò)細胞培養測試的。

　　· 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現，因為病毒顆粒特別微小，一般的實(shí)驗室都沒(méi)能力檢查細胞培養中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內，對整個(gè)細胞培養不是致死的，所以它可能會(huì )使研究人員長(cháng)期得到受病毒影響的細胞的實(shí)驗結果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現細胞培養中的支原體污染。90年代初美國的一個(gè)調查發(fā)現，在該國的細胞培養中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒(méi)有細胞壁，在細胞培養液中幾乎是透明的，同時(shí)對常用于細胞培養中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現，但是其存在會(huì )影響實(shí)驗的結果。

　　細胞的交叉污染在細胞培養中發(fā)生的嚴重程度大大超過(guò)人們的想象：1981 年對ATCC細胞株的調查顯示：超過(guò) 60 標記為其他細胞株的細胞居然是 HeLa 細胞。

　　怎么樣才能減少污染的機會(huì )?

　　減少化學(xué)污染

　　對于自己用粉末配制培養液的實(shí)驗室來(lái)說(shuō)，配制培養液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機會(huì )。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過(guò)細胞培養測試的。

　　· 另外盡量使用一次性的細胞培養器皿。由于標準廠(chǎng)家一次性細胞培養器皿的生產(chǎn)環(huán)境比較嚴格，得到的產(chǎn)品潔凈度很高，從而減少了由細胞培養器皿帶入污染的機會(huì )。

　　減少生物污染

　　由于一般的污染發(fā)生在細胞培養的操作過(guò)程中，所以良好的細胞培養操作環(huán)境和操作習慣是減少生物污染的關(guān)鍵。

　　要用一個(gè)專(zhuān)門(mén)的房間用于細胞培養，注意保持房間的清潔。

　　要有一個(gè)定期檢驗的合格的超凈臺(超凈臺內的潔凈度應該為100級，與計算機硬盤(pán)的生產(chǎn)環(huán)境相當)。在使用超凈臺前開(kāi)啟通風(fēng)裝置并打開(kāi)紫外燈滅菌30分鐘。操作時(shí)要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺的非無(wú)菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養液的瓶子要加入漂 白液，以避免微生物的生長(cháng)。每次實(shí)驗完后，要向通向廢培養液瓶的塑料管內噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺面(只用70%酒精擦拭會(huì )導致灑落在臺面的培養液在臺面上形成難以清除的污垢)。

　　不要在超凈臺里使用酒精燈等燈具，因為這樣會(huì )因燈的熱的火焰引起的空氣對流而破壞超凈臺里本來(lái)規則的空氣層流，使本來(lái)存在于超凈臺底層的微粒被帶到上層，帶來(lái)更多的污染機會(huì )。

　　·加熱培養液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長(cháng)，從而成為一個(gè)重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。細胞培養箱內的用于保持濕度的水盤(pán)也需要定期清洗。為了減少不同細胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養液或胰酶培養不同的細胞;不要在一個(gè)超凈臺上同時(shí)進(jìn)行多種細胞的操作�！　》盅b每次小量使用的溶液(如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液)，以減少多次使用時(shí)污染的機會(huì )。

　　以防萬(wàn)一

　　即使再小心，污染難免還是會(huì )發(fā)生。所以得到一個(gè)新的細胞株后的第一件事情，是把細胞生長(cháng)擴增后凍存起來(lái)，以備不測。

　　內毒素是什么?

　　內毒素的化學(xué)成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組分之一。一個(gè)活的細菌很少釋放內毒素，但死后可放出大量?jì)榷舅亍?

　　內毒素在血液中存在時(shí)會(huì )引起動(dòng)物發(fā)熱，是醫療注射液中最主要的。19 世紀 40 年代開(kāi)始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應實(shí)驗來(lái)檢測熱原(主要是細菌內毒素)。后來(lái)研究者發(fā)現鱟(一種海洋生物)血液遇到極微量的內毒素會(huì )發(fā)生凝血反應，從而在19 世紀 70 年代發(fā)明了鱟試劑用于快速精確檢測內毒素。內毒素含量一般用國際單位( EU )來(lái)衡量，一般來(lái)說(shuō) 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。

　　由于內毒素會(huì )對很多種細胞產(chǎn)生刺激，影響實(shí)驗結果，所以在實(shí)驗中要盡量減少在培養液中的內毒素的來(lái)源。

　　由于生產(chǎn)工藝的提高，來(lái)自標準廠(chǎng)家的血清和培養液中的內毒素含量很少。所以現代實(shí)驗室細胞培養中內毒素的來(lái)源主要是水、添加劑、細胞培養器皿等�！　�傳統的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過(guò)離子交換柱、活性炭柱和超濾三個(gè)環(huán)節的純水制備儀制備的超純水都能滿(mǎn)足細胞培養用水的要求。盛水器具上的細菌內毒素可能給超純水帶來(lái)污染。長(cháng)時(shí)間放置的超純水也可因盛水器具上細菌生長(cháng)而污染細菌內毒素。

　　內毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實(shí)驗室里用普通的方法不能完全的消除除內毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時(shí)干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內毒素。

　　一次性塑料器皿經(jīng)過(guò)高溫注塑成型，沒(méi)有內毒素存在。但在處理、包裝等生產(chǎn)過(guò)程中，可能污染內毒素。

　　應該選用什么樣的抗生素和相應的濃度?

　　抗生素在五十年代開(kāi)始細胞培養中得到使用。它大大減少了細胞培養中細菌等微生物污染的機會(huì )，從而使細胞培養在普通實(shí)驗室就可以輕易操作。

　　·最常用的抗生素是芐基青霉素鉀鹽 (Penicillin G potassium )和鏈霉素硫酸鹽 ( Streptomycin sulphate)的混合液，通稱(chēng)PS。青霉素抑制細菌細胞壁的合成，鏈霉素則抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。一般青霉素的濃度為10,000U/ml, 鏈霉素的濃度為10,000ug/ml。青霉素在普通的醫院或藥店可以買(mǎi)到。鏈霉素由于對聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)具有損害，已經(jīng)很少用于醫療，所以需要向專(zhuān)門(mén)的化學(xué)試劑公司購買(mǎi)。

　　有一些培養過(guò)程污染源比較多，比如組織培養。為了減少污染，常常需要在培養液中加入其他的抗生素。比如慶大霉素(Gentamycin sulfate，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成)， 兩性霉素B (amphotericin B，干擾含膽固醇的細胞膜的功能，抑制酵母和真菌的生長(cháng)，對培養細胞也具有一定的毒性)等。

　　可用于細胞培養的抗生素種類(lèi)非常多，如果細胞培養過(guò)程比較特殊，污染源比較多，可以考慮選用其他的抗生素。

　　即使使用多種抗生素的組合，污染還是有可能發(fā)生。所以減少污染的關(guān)鍵，是規范的實(shí)驗環(huán)境和操作�？股�素的使用，也會(huì )使一些污染長(cháng)期潛伏，同時(shí)與五十年代抗生素開(kāi)始引入細胞培養時(shí)相比，現在的過(guò)濾技術(shù)，超凈臺的質(zhì)量等都已經(jīng)有了很大的提高，在培養過(guò)程中帶入污染的機會(huì )大大減小了，所以有不少人建議在普通的細胞培養過(guò)程中不要使用抗生素。

　　為什么有人提倡細胞培養液中不要加抗生素?

　　抗生素雖然減少了可以觀(guān)察到的細菌、酵母等微生物的污染機會(huì )，卻會(huì )增加支原體、病毒等隱性污染的機會(huì )。

　　因為細胞培養中污染主要來(lái)源于空氣中的微粒和汽霧，而這些微粒和汽霧可以同時(shí)攜帶支原體、病毒和其他微生物。當抗生素使用時(shí)，可見(jiàn)污染被抑制而隱性污染又沒(méi)被注意到，這樣支原體、病毒等隱性污染的機會(huì )反而增加了。Barile的一項研究顯示(1)，72%持續使用抗生素培養的細胞有支原體污染，而不使用抗生素培養的細胞支原體污染的比例只有7%。

　　反過(guò)來(lái)如果不使用抗生素，支原體、病毒的污染往往會(huì )伴隨細菌和酵母等的污染。由于細菌和酵母等的污染很容易觀(guān)察到，污染細胞的及時(shí)清理就大大減少了支原體、病毒的污染機會(huì )。

　　潛在的支原體、病毒的污染會(huì )帶來(lái)很大的危害。這些微生物的存在會(huì )影響細胞的理化性質(zhì)，從而使研究者得到錯誤的實(shí)驗結果。在嚴重的情況下，甚至使一個(gè)實(shí)驗室數年的研究白白浪費。

　　由于過(guò)濾技術(shù)的提高和超凈臺質(zhì)量的改進(jìn)，在規范的細胞培養操作過(guò)程中引進(jìn)污染的機會(huì )已經(jīng)被大大降低了。所以比較合理的建議是，在常規的細胞培養中不要使用抗生素。只有在培養污染源很多(比如組織培養)，或者培養非常珍貴的細胞株時(shí)才使用抗生素。

　　1. Barile, M. F. Mycoplasmal Contamination of Cell Cultures: mycoplasma-Virus-Cell Culture Interactions. in Contamination in Tissue Culture, J. Fogh, ed. (Academic Press, Inc., New York, 1973) 131-171. 38. Perlman, D. Use of Antibiotics in Cell

　　直接培養法檢測細胞培養中的支原體污染

　　特點(diǎn): 最直接最靈敏的檢測手段。

　　缺點(diǎn)： 培養時(shí)間長(cháng)，需3-5周才能判斷。有些支原體不能在培養基上培養出來(lái)(例如M. hyorhinis)。需要同時(shí)培養支原體菌株作陽(yáng)性對照，可能會(huì )造成污染。

　　材料： 葡萄糖、L-鹽酸精氨酸、Difco PPLO broth(Difco 0554-17-1)、馬血清、15%酵母膏溶液(高壓滅菌)、Bacto agar、無(wú)菌有蓋螺旋試管(高壓滅菌)、無(wú)菌培養皿(60x15mm)、玻璃棒、37℃培養箱、厭氧缸(厭氧缸長(cháng)期培養易有污染，所以厭氧包應該用無(wú)菌水，每次打開(kāi)厭氧缸后用70%酒精擦拭內壁。)

　　培養基準備： 基本配方為Difco PPLO broth(60%)，馬血清(20%)，15%酵母膏溶液(10%)，10x儲存液(10%)。由于培養時(shí)間長(cháng)，可加50u/ml青霉素至10x儲存液或加入乙酸鉈(1：2000)至培養基中以防止其他細菌的污染。

　　10x儲存液(1升)： 稱(chēng)取50克葡萄糖，10克L-鹽酸精氨酸溶于1升蒸餾水中。用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，分裝100ml至瓶中，-70℃保存。

　　液體培養基(1升)： 稱(chēng)取21克Difco PPLO broth，0.02克酚紅于600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解。滅菌121℃15分鐘滅菌。待溫度降低至室溫后于無(wú)菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解凍的10x儲存液，混合均勻后分裝至已滅菌的有蓋螺旋試管中，10ml/管。4℃保存，保存期限為1個(gè)月。