過(guò)氧化氫酶測定步驟

　　過(guò)氧化氫酶

　　測定步驟：

　　(1)SOD提�。�

　　稱(chēng)取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸緩沖液，研磨攪拌20分鐘，使SOD充分溶解，6000rpm離心，棄去沉淀，得上清液。(留出1mL備用，準確量取剩余上清液體積，記錄)

　　(2)除雜蛋白：

　　提取液加入1/4體積的氯仿-乙醇混合液攪拌10min，6000rpm離心15min去沉淀，得粗酶液。(取1mL粗酶液備用,精確測量剩余粗酶液體積)

　　(3)SOD酶的沉淀分離：

　　剩余的粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000rpm離心15min，得到SOD酶沉淀。將沉淀先加2mL磷酸緩沖液，溶解后再加3mL混勻。6000rpm離心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL備用，其余量取體積。

　　(4)粗酶液活性測定：

　　提取液、粗酶液、酶液中SOD活力檢測，具體步驟如下。

　　加入鄰苯三酚后迅速混勻，準確計時(shí)4min，加一滴濃鹽酸停止反應，420nm測吸光值。

　　試劑/(mL)

　　空白管

　　對照管OD1

　　提取液OD2

　　粗酶液OD2

　　酶液OD2

　　PH8.3緩沖液

　　3

　　3

　　3

　　3

　　3

　　SOD提取液

　　0

　　0

　　0.1

　　0.1

　　0.1

　　蒸餾水

　　2

　　1.8

　　1.7

　　1.7

　　1.7

　　室溫放置20min

　　鄰苯三酚

　　0

　　0.2

　　0.2

　　0.2

　　0.2

　　(5)溶液中可溶性蛋白含量測定：

　　分別從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍數稀釋?zhuān)?60nm/280nm測定吸光值，按公式計算蛋白質(zhì)濃度。

　　提取液稀釋?zhuān)?0 ×

　　粗酶液稀釋?zhuān)?0 ×

　　酶液稀釋?zhuān)?0 ×