蛋白質(zhì)、多肽液相色譜純化方法簡(jiǎn)介

　　多肽是α-氨基酸以肽鏈連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類(lèi)推還有三肽、四肽、五肽等。

　　1、純化的一般目標和方法首先，自然來(lái)源或者重組表達的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一些粗提的步驟(例如：勻漿、離心、硫酸銨沉淀等)成為穩定的可以用于色譜分離的樣品。

　　然后進(jìn)行捕獲色譜(capture chromatography)，主要目標是濃縮和去除大量的容易去除的雜質(zhì)，此步最關(guān)心的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝膠。

　　經(jīng)過(guò)濃縮的部分純化的樣品進(jìn)行中級色譜(intermediate chromatography)，目的是去除較難去除的雜質(zhì)，此步最關(guān)心的是分辨率，常采用高分辨率的細顆粒凝膠。

　　最后為了得到符合要求的最終產(chǎn)品，去除殘存的雜質(zhì)以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進(jìn)行精制色譜(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝膠過(guò)濾凝膠進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜。

　　2、純化前的準備工作

　　(1)樣品穩定性試驗a、測定樣品在pH 2-9的穩定性;b、測定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸銨中的穩定性;c、測定樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩定性;d、測定樣品在4-40℃的穩定性;e、室溫下靜置過(guò)夜，測定對蛋白水解酶的穩定性。

　　(2)樣品預處理a、去除樣品中顆粒物(0.45-0.22微米膜過(guò)濾或者10000 g離心15分鐘)

　　b、去除樣品中脂類(lèi)( 10000 g離心15分鐘或有機溶劑抽提)

　　c、去除樣品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)

　　d、抑制樣品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制劑、低溫下快速第一步分離或在蛋白酶缺陷宿主中表達重組蛋白)

　　(3)樣品的保存條件：短期儲存(小于24小時(shí))

　　a、避免接近或超過(guò)樣品的穩定極限防止蛋白質(zhì)變性或沉淀b、在密閉容器中冰箱冷藏較長(cháng)期儲存(數天)

　　a、b、同上c、加入適當的抑菌劑長(cháng)期儲存a、同上b、冰凍或者最好凍干(真空冷凍干燥)保存。

　　3、對每一純化步驟的評價(jià)相關(guān)方法的建立a、目的蛋白含量測定酶活性測定、生物活性測定、放射免疫、酶聯(lián)免疫、免疫電泳、熒光。

　　b、總蛋白含量測定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結合法(考馬斯亮蘭G-250)等。

　　c、樣品復雜度檢測HPLC(離子交換、凝膠過(guò)濾、反相)、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳(CE)。

　　4、蛋白質(zhì)的來(lái)源

　　(1)天然蛋白： 天然產(chǎn)物中的目的蛋白一般含量很少而且組分極復雜，在分離過(guò)程中須采用多步驟才能去除各種雜質(zhì)，并應在整個(gè)過(guò)程中降低蛋白水解酶的活性。

　　(2) 重組蛋白： 重組蛋白則目標蛋白的豐度較高。重組蛋白主要有三種表達定位：a、細胞質(zhì)：在種情況下，必須破壞細胞結構才能得到目的蛋白質(zhì)，同時(shí)伴隨著(zhù)大量核酸和其它上 千種宿主蛋白質(zhì)的釋放;在表達量較高的條件下，一般形成包涵體，包涵體含有過(guò)表達目的蛋白，且容易通過(guò)高速離心分離，但是包涵體的溶解與復性是較復雜的。

　　b、外周質(zhì)： 表達的蛋白質(zhì)存在于細菌內膜與外膜之間，這樣目的蛋白可以較少地受到蛋白酶的作用并減少了宿主蛋白的污染。

　　c、分泌到培養基：這種表達一般蛋白質(zhì)濃度較低，主要受到培養基中的污染。