高效液相色譜儀的系統組成、工作原理

　　高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統,樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內,由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數,在兩相中作相對運動(dòng)時(shí),經(jīng)過(guò)反復多次的吸附-解吸的分配過(guò)程。

　　高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)也叫高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography)、高速液相色譜(highspeedliquidchromatography)、高分離度液相色譜(highresolutionliquidchromatography)等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì )引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜。

　　高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統由流動(dòng)相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類(lèi)似于氣相色譜，但是針對其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩;進(jìn)樣系統要求進(jìn)樣便利切換嚴密;由于液體流動(dòng)相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長(cháng)度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個(gè)領(lǐng)域。

　　使用高效液相色譜時(shí)，液體待檢測物被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開(kāi)色譜柱，通過(guò)檢測器得到不同的峰信號，最后通過(guò)分析比對這些信號來(lái)判斷待側物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。

　　發(fā)展歷史：

　　1960年代，由于氣相色譜對高沸點(diǎn)有機物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內完成。

　　1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實(shí)踐》一書(shū)，標志著(zhù)高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學(xué)、生物化學(xué)、醫學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數據處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。

　　1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著(zhù)困境，后來(lái)的研究人員便采用微粒固定相來(lái)突破著(zhù)一瓶頸�？瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實(shí)現了高速傳質(zhì)，為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩固的基礎。隨著(zhù)填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實(shí)現。1960年代研制出氣動(dòng)放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵，但后者的脈沖信號很大，難以滿(mǎn)足高效液相色譜的要求。1970年代，往復式雙柱塞恒流泵，解決了這一問(wèn)題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7μm，具有極好的柱效，并逐漸取代了無(wú)定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問(wèn)題，人們越來(lái)越認識到改變流動(dòng)相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。

　　高效液相色譜的特點(diǎn)：

　　高壓——壓力可達150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。

　　高速——流速為0.1～10.0mL/min。

　　高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達100種。

　　高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。

　　HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

　　速度快——通常分析一個(gè)樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內即可完成。

　　分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達到最佳分離效果。

　　靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。

　　色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

　　樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。