熒光RT-PCR技術(shù)可快速檢測H7N9禽流感病毒

　　截至21日H7N9禽流感已確診102例，雖未有大面積爆發(fā)，但快速檢測與診斷、確診疫情發(fā)生與否已成為防控工作的關(guān)鍵。4月17日，北京檢驗檢疫局承擔的國家質(zhì)檢總局科技計劃項目“禽流感病毒H7N9亞型雙重熒光RT-PCR定型技術(shù)研究”鑒定會(huì )上，專(zhuān)家組一致同意項目成果通過(guò)鑒定，并建議在進(jìn)一步擴大和完善動(dòng)物臨床驗證實(shí)驗基礎上，盡快推廣應用。

　　目前，在國內通用的確診禽類(lèi)中禽流感病毒H7N9亞型的檢測技術(shù)中，除采用傳統的雞胚病毒分離方法外，通常采用核酸檢測方法，如普通PCR方法和基于熒光RT-PCR的“二步法”，但還沒(méi)有建立起采用熒光RT-PCR技術(shù)“一步法”檢測禽流感病毒H7N9亞型的方法。

　　據該項目組負責人、北京局檢驗檢疫技術(shù)中心動(dòng)物實(shí)驗室博士高志強介紹，項目在實(shí)驗過(guò)程中，共建立了3種檢測方法。最終的禽流感病毒H7N9亞型雙重熒光RT-PCR檢測方法是在禽流感病毒H7亞型和N9亞型單重熒光RT-PCR檢測方法的基礎上通過(guò)優(yōu)化建立，從而實(shí)現了對禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型。這種方法不僅能檢測最近流行的H7N9毒株，還可以用于篩查其他H7亞型毒株。此方法不僅引物特異，而且探針特異，這一“雙特異”性保證了結果的準確性，同時(shí)比普通PCR檢測技術(shù)要靈敏100~1000倍。

　　熒光RT-PCR檢測禽流感病毒原理

　　熒光RT-PCR就是在聚合酶鏈式反應(PCR)原有的一對特異性引物基礎上增加了一條特異性熒光雙標記探針。標準主要起草單位——北京出入境檢驗檢疫局的科研人員根據A型流感病毒的核酸保守區共有序列，開(kāi)發(fā)設計上百對引物和幾十條探針序列，從中篩選出了敏感、特異的引物、探針，建立快速的通用型一步法檢測活禽或禽產(chǎn)品中所有A型禽流感病毒及針對H5、H7、H9亞型的熒光RT-PCR檢測技術(shù)。

　　PCR反應進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，在合成了N條新鏈的同時(shí)，就水解了N條探針，并釋放出了相應數量的熒光基團。儀器所接收到熒光信號的強度與PCR反應產(chǎn)物的量呈對應關(guān)系。隨著(zhù)PCR反應的循環(huán)往復，PCR產(chǎn)物呈指數形式增長(cháng)，熒光信號也相應增長(cháng)。如果以每一個(gè)PCR循環(huán)結束時(shí)所測得的熒光值為縱坐標，以PCR循環(huán)數為橫坐標作圖，即可得到一條連接每一個(gè)循環(huán)后熒光值的擴增曲線(xiàn)。當檢測標本中含有所要檢測病原體的核酸序列時(shí)，所得到的曲線(xiàn)呈“S”型;而當標本中不含病原體，則PCR過(guò)程不發(fā)生，探針不被水解，不產(chǎn)生熒光信號，其擴增曲線(xiàn)為一水平線(xiàn)。也就是說(shuō)，擴增曲線(xiàn)為“S”型時(shí)，就檢出了禽流感病毒;當擴增曲線(xiàn)為水平線(xiàn)時(shí)，就沒(méi)有禽流感病毒檢出。利用熒光RT-PCR檢測方法的4項標準有3項分別是對H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測提出的，還有一項是通用檢測方法的標準。北京出入境檢驗檢疫局動(dòng)物檢驗檢疫實(shí)驗室主任張鶴曉介紹說(shuō)，該方法可以檢測H1～H15的各種禽流感病毒。

　　禽流感病毒各亞型均屬A型流感病毒，根據A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針。該探針與禽流感病毒特有的共同基因特異性結合，結合部位位于引物結合區域內。探針的5’端和3’端分別標記不同的熒光素，如5’端標記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測儀器接收，稱(chēng)為報告熒光基團(用R表示)，3’端一般標記TAMRA熒光素，它在近距離內能吸收5’端報告熒光基團發(fā)出的熒光信號，稱(chēng)為淬滅熒光基團(用Q表示)。

　　當PCR反應在退火階段時(shí)，一對引物和一條探針同時(shí)與目的基因片段結合，此時(shí)探針上R基團發(fā)出的熒光信號被Q基團所吸收，儀器檢測不到R所發(fā)出的熒光信號;當PCR反應進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶在引物的引導下，以四種核苷酸為底物，根據堿基配對的原則，沿著(zhù)模板鏈合成新鏈;當鏈的延伸進(jìn)行到探針結合部位時(shí)，受到探針的阻礙而無(wú)法繼續，此時(shí)的Taq酶發(fā)揮它的5’→3’外切核酸酶的功能，將探針水解成單核苷酸，消除阻礙，與此同時(shí)標記在探針上的R基團游離出來(lái)，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測儀所接收;在Taq酶的作用下繼續延伸過(guò)程合成完整的新鏈，R和Q基團均游離于溶液中，儀器可繼續檢測到R所發(fā)出的熒光信號。

　　熒光RT-PCR檢測法特點(diǎn)

　　敏感性高、特異性強：熒光RT-PCR檢測方法不僅能夠用來(lái)檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型，對其他禽流感病毒亞型也能檢出，而且用通用型探針、引物檢測常見(jiàn)的其他禽類(lèi)病毒，未發(fā)現交叉反應，這就說(shuō)明該方法敏感性高、特異性強。

　　節約檢測時(shí)間：在檢驗檢疫實(shí)踐中，如果用僅針對某一亞型禽流感病毒的探針、引物，一個(gè)亞型一個(gè)亞型的測試，勢必會(huì )浪費人力、物力和時(shí)間。因此，先用通用型探針、引物驗證是否是禽流感病毒，再用亞型的探針、引物分型，將大大節約檢測時(shí)間。

　　不易污染：熒光RT-PCR技術(shù)通過(guò)連接電腦分析PCR過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號，實(shí)現了實(shí)時(shí)、在線(xiàn)檢測PCR擴增過(guò)程，而無(wú)需對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，克服了傳統的PCR技術(shù)易污染的缺點(diǎn)，可實(shí)現在同一個(gè)標準的操作程序條件下進(jìn)行穩定、可靠的檢測。