高效液相色譜法的主要類(lèi)型和分離原理

　　根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類(lèi)型：

　　1.液—液分配色譜法(Liquid-liquidPartitionChromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(ChemicallyBondedPhaseChromatography)

　　流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應互不相溶(極性不同，避免固定液流失)，有一個(gè)明顯的分界面。當試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達到平衡時(shí)，服從于下式：

　　式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度;cm--溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度;Vs—固定相的體積;Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大;但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對K影響不大，LLPC流動(dòng)相對K影響較大。

　　a.正相液—液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。

　　b.反相液—液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。

　　c.液—液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解;流動(dòng)相通過(guò)拾步便民新昌色譜柱時(shí)的機械沖擊力，會(huì )造成固定液流失。上世紀70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相(見(jiàn)后)，可克服上述缺點(diǎn)�，F在應用很廣泛(70~80%)。

　　2.液—固色譜法

　　流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑(如硅膠、氧化鋁等)。這是根據物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。其作用機制是：當試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附(未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S)，可表示如下：

　　Xm nSa======Xa nSm

　　式中：Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子;Sa--固定相中的溶劑分子;Xa--固定相中的溶質(zhì)分子;Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子。

　　當吸附競爭反應達平衡時(shí)：

　　K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

　　式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]

　　3.離子交換色譜法(Ion-exchangeChromatography)

　　IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

　　以陰離子交換劑為例，其交換過(guò)程可表示如下：

　　X-(溶劑中) (樹(shù)脂-R4N Cl-)===(樹(shù)脂-R4N X-) Cl-(溶劑中)

　　當交換達平衡時(shí)：

　　KX=[-R4N X-][Cl-]/[-R4N Cl-][X-]

　　分配系數為：

　　DX=[-R4N X-]/[X-]=KX[-R4N Cl-]/[Cl-]

　　[討論：DX與保留值的關(guān)系]

　　凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。

　　4.離子對色譜法(IonPairChromatography)

　　離子對色譜法是將一種(或多種)與溶質(zhì)分子電荷相反的離子(稱(chēng)為對離子或反離子)加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原理可用下式表示：

　　X 水相 Y-水相===X Y-有機相

　　式中：X 水相--流動(dòng)相中待分離的有機離子(也可是陽(yáng)離子);Y-水相--流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等);X Y---形成的離子對化合物。

　　當達平衡時(shí)：

　　KXY=[X Y-]有機相/[X ]水相[Y-]水相

　　根據定義，分配系數為：

　　DX=[X Y-]有機相/[X ]水相=KXY[Y-]水相

　　[討論：DX與保留值的關(guān)系]

　　離子對色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。

　　5.離子色譜法(IonChromatography)

　　用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動(dòng)相中強電解質(zhì)背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。

　　以陰離子交換樹(shù)脂(R-OH)作固定相，分離陰離子(如Br-)為例。當待測陰離子Br-隨流動(dòng)相(NaOH)進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(洗脫反應為交換反應的逆過(guò)程)：

　　抑制柱上發(fā)生的反應：

　　R-H Na OH-===R-Na H2O

　　R-H Na Br-===R-Na H Br-

　　可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響;試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。

　　離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽(yáng)離子分析。

　　6.空間排阻色譜法(StericExclusionChromatography)

　　空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現。