如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術(shù)

　　western blot技術(shù)在蛋白定量分析中的選擇應用

　　蛋白質(zhì)印跡(western blot)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot 是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡(western blot)具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術(shù)。免疫印跡(western blot)常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

　　如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術(shù)?通常，Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：1、放射自顯影;2、底物化學(xué)發(fā)光ECL;3、底物熒光ECF;4、底物DAB呈色等。下面我們將分別對這四種方法進(jìn)行介紹，同時(shí)向大家呈現每種方法的應用特點(diǎn)。

　　放射自顯影radioautography：利用放射性核素發(fā)射的射線(xiàn)，使感光材料中的鹵化銀等感光，顯出影像后進(jìn)行放射性標記物的定位和定量測量的技術(shù)。此技術(shù)的特點(diǎn)是靈敏度高、分辨率好、保存時(shí)間長(cháng)久，但由于實(shí)驗所用方式性物質(zhì)對人體有輻射作用，目前該技術(shù)在蛋白研究中應用較少，多用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。

　　底物DAB呈色：二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)是辣根過(guò)氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應產(chǎn)物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡(Western Blot,WB)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)和免疫細胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)、斑點(diǎn)印跡(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和顯色反應。用之進(jìn)行對底物顯色即被稱(chēng)為底物DAB呈色法。此技術(shù)成本低，操作也較簡(jiǎn)單是常用的western blot成像分析技術(shù)之一，不過(guò)由于其靈敏度稍低，在目的蛋白表達量較少的情況下可能沒(méi)有理想的結果應慎用。

　　底物化學(xué)發(fā)光ECL：化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應中吸收了反應釋放的化學(xué)能,而處于電子激發(fā)態(tài)的反應中間體或反應產(chǎn)物由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的一種光輻射,化學(xué)發(fā)光分析是根據化學(xué)反應產(chǎn)物的光輻射(化學(xué)發(fā)光)確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法。它的特點(diǎn)是靈敏度高和線(xiàn)性范圍寬，不需要任何光源。

　　傳統的化學(xué)發(fā)光檢測方法通常需要膠片成像，膠片成像可以保證較高的靈敏度，但也有很多缺點(diǎn)：耗時(shí)，需要暗房和顯影劑，膠片很貴，而且需要很多消耗品，需要持續購買(mǎi)。另外，用膠片上的蛋白條帶進(jìn)行定量也是幾乎不可能，和目測一塊考馬斯藍染的膠沒(méi)什么區別，而且膠片成像時(shí)間只能預先設定，如果曝光過(guò)度或者不足則需要再次進(jìn)行實(shí)驗，非常麻煩。

　　數字成像系統的出現極大克服了傳統膠片法的一些弊端，近年來(lái)隨著(zhù)冷卻CCD技術(shù)的發(fā)展，數字成像系統成本越來(lái)越低，成像效果同時(shí)獲得大大提升，因而CCD成像系統逐漸成為了實(shí)驗室Western Blot的主要設備。同時(shí)目前很多Western blot的新技術(shù)也都是針對CCD成像系統的，目前CCD成像系統的靈敏度已經(jīng)可以達到甚至超過(guò)傳統的膠片成像。冷卻型CCD照相機與X膠片相比具有瞬時(shí)影像處理、高靈敏度、高分辨率、動(dòng)力學(xué)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，而且還不需要膠片處理裝置、后續耗材投入及暗室。

　　底物熒光ECF：是利用的熒光染料(如Cy2 ,Cy3, Cy5)標記二抗，標記熒光染料的二

　　抗分別對應相應的目的蛋白，以此實(shí)現通過(guò)檢測熒光染料的信號強度，實(shí)現種蛋白信號的檢測，以進(jìn)行精確的定量分析。熒光檢測Western Blot本來(lái)不是檢測的主流方法，不過(guò)熒光法檢測允許在同一張轉印膜上用不同顏色的熒光底物同時(shí)檢測不同的目標。

　　在做western blot的檢測時(shí)，有時(shí)會(huì )碰到電泳后兩個(gè)分子量相近的蛋白分離不開(kāi)，距離相近或者重疊，例如磷酸化和非磷酸化的蛋白;或者是同一次實(shí)驗中，檢測一種以上的蛋白抑或是利用內參蛋白對目的蛋白的定量分析進(jìn)行標準化。遇到以上這樣的實(shí)驗需求，化學(xué)發(fā)光的檢測方法會(huì )顯得繁瑣復雜，其必須經(jīng)過(guò)剝脫抗體和重行孵育新抗體的過(guò)程，不僅耗時(shí)費力，而且不能進(jìn)行精確的定量分析，由此多色熒光成像的技術(shù)應運而生。多色熒光成像，是利用不同的熒光染料(如Cy2 ,Cy3, Cy5)標記二抗，標記不同熒光染繞的二抗分別對應不同的目的蛋白，以此實(shí)現通過(guò)檢測不同熒光染料的信號強度，間接實(shí)現一次實(shí)驗可檢測多種蛋白，同時(shí)也可以進(jìn)行精確的定量分析。

　　總之，經(jīng)典的western blot技術(shù)結合不斷進(jìn)步的科學(xué)技術(shù)，使蛋白定量分析更靈敏、操作更加簡(jiǎn)便。同時(shí)，western blot技術(shù)儀器也更加專(zhuān)一、高效，這就要求我們在開(kāi)展western blot實(shí)驗時(shí)，需要就如何選擇蛋白印跡成像與定量分析技術(shù)進(jìn)行選擇確定，以保證選擇工具的適用性。