免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗方法及其分類(lèi)

　　一、免疫標記法及其分類(lèi)

　　1.熒光免疫法

　　原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時(shí)釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線(xiàn)性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點(diǎn)。

　　以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結合抗體，然后加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復合物。洗滌除去未結合物，接著(zhù)加入熒光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體—抗原—抗體復合物。最后根據熒光強度，即可對蛋白抗原進(jìn)行定量。

　　傳統的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時(shí)間分辨熒光免疫測定法是以具有特長(cháng)壽命的稀土金屬如銪，作為標記物，加入正常液后激發(fā)測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。

　　2.放射免疫法

　　放射免疫法是以過(guò)量的未標記抗原與放射性物質(zhì)標記的抗原，競爭性地與抗體結合，形成有放射性的抗原—抗體復合物與無(wú)放射性的抗原—抗體復合物，并有過(guò)剩的標記抗原與未標記的抗原。然后通過(guò)離心沉淀等方法，將抗原—抗體復合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標準曲線(xiàn)比較，即可對未標記的待測抗原進(jìn)行定量。

　　RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準確定量到ng/ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時(shí)長(cháng)，且有放射性污染。近年來(lái)，隨著(zhù)單克隆抗體的應用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡(jiǎn)化，并已有商品試劑盒供應，使用方便。

　　3.酶聯(lián)免疫法(ELISA)

　　ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標準或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結合的原理而建立，該法的最低檢測限為10μg/L，線(xiàn)性范圍達1 000ug/L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關(guān)性(r=0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡(jiǎn)單，適用于多份標本的檢測，不需特殊儀器設備等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。

　　以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復合物。接著(zhù)加入酶標二抗，形成抗原—抗體—抗體復合物。最后加入底物，由酶催化底物生成產(chǎn)物。通過(guò)產(chǎn)物的生成量即可對蛋白抗原進(jìn)行定量。

　　4.偶聯(lián)生物素—親和素系統的酶免法

　　利用了一個(gè)親和素分子可以與4個(gè)生物素分子結合的特性，使傳統的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。

　　5.時(shí)間分辨熒光免疫分析

　　時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光，同時(shí)檢測波長(cháng)和時(shí)間兩個(gè)參數進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。

　　6.解離增強鑭系元素熒光免疫分析

　　解離增強鑭系元素熒光免疫分析(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA)是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪(Eu)連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經(jīng)過(guò)免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從復合物上解離下來(lái)，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬(wàn)倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱(chēng)為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。

　　二、熒光抗體染色方法及其分類(lèi)

　　1.直接染色法

　　將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見(jiàn)到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高，操作簡(jiǎn)便，比較快速。缺點(diǎn)是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽(yáng)性標本對照，抑制試驗對照。

　　2.間接染色法

　　如果檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體(第一抗體)與抗原標本進(jìn)行反應，作用一定時(shí)間后，洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體即抗球蛋白抗體(第二抗體)與抗原標本反應，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應，則抗體被固定或與熒光素標記的抗抗體結合，形成抗原-抗體-抗抗體復合物，再洗去未反應的標記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標記的抗體起著(zhù)雙重作用，對抗原來(lái)說(shuō)起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

　　由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動(dòng)物血清球蛋白免疫其他動(dòng)物來(lái)制備。

　　間接染色法的優(yōu)點(diǎn)是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體;用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點(diǎn)是：由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結果有時(shí)較難，操作繁瑣，對照較多，時(shí)間長(cháng)。間接法應設陰、陽(yáng)性標本對照，還應設有中間層對照(即中間層加陰性血清代替陽(yáng)性血清)。

　　3.抗補體染色法

　　抗補體染色法簡(jiǎn)稱(chēng)補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。染色程序也分二步：先將未標記的抗體和補體加在抗原標本上，使其發(fā)生反應，水洗，然后再加標記的抗補體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應，形成復合物，則補體便被抗原抗體復合物結合，第二步加入的熒光素標記的抗補體抗體便與補體發(fā)生特異性反應，使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發(fā)出熒光。

　　抗補體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點(diǎn)，此外，還有其獨特的優(yōu)點(diǎn)：即只需要一種標記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統。因為補體的作用沒(méi)有特異性，它可以與任何哺乳動(dòng)物的抗原-抗體系統發(fā)生反應。它的缺點(diǎn)是參與反應的成分多，染色程序較復雜，比較麻煩。

　　除上述三種方法外，還有在此基礎上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補體法等等。