生物樣本冷凍儲存技術(shù)

　　1 儲存溫度

　　生物樣本的長(cháng)期儲存通常使用盡可能低的溫度來(lái)降低樣本內的生化反應提高樣本內各種成分的穩定性。生物大分子、細胞、組織和器官的常用儲存溫度有-800C(超低溫冰箱), -1400C(液氮氣相或深冷冰箱)以及-1960C(液氮液相)，溫度越低樣本的穩定保存時(shí)間越長(cháng)。0～-600C是水的結晶溫度，容易對細胞和組織的微觀(guān)結構造成傷害，一般不使用這一溫度來(lái)保存組織和細胞。部分經(jīng)過(guò)提純的生物大分子可以在0～-600C穩定保存一定時(shí)間，但在組織樣本內生物大分子受到細胞組織內多種因素的影響，穩定性有可能明顯降低，所以通常樣本庫不使用0～-600C作為儲存溫度。

　　-800C樣本儲存

　　-800C低于危害性較大的水的結晶溫度范圍，也是常用設備超低溫冰箱能達到的溫度，基于操作簡(jiǎn)便性、儲存量和成本等因素來(lái)考量，這一溫度也是目前保存樣本中生物大分子活性的常用溫度。但對不同的生物大分子活性這一溫度下能保持多久仍無(wú)定論。組織中DNA的穩定性可以在-800C下可以保持數年或更長(cháng)時(shí)間。但對RNA來(lái)說(shuō)，則容易被廣泛分布于細胞和各種組織里的RNA酶逐漸降解，在不同的細胞和組織中，RNA穩定儲存的時(shí)間長(cháng)短也有較大的區別，但一般不超過(guò)5年，在一些敏感實(shí)驗內，RNA在-800C下不到一年就發(fā)生了測得出的降解，所以為長(cháng)期保存RNA活性，建議使用更低的溫度，或者利用小部分樣本提取RNA與剩余樣本同步儲存。其他樣本內的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等生物大分子在樣本內在-800C下也能保存，但時(shí)間長(cháng)短不一，穩定性逐漸衰減。如果為保護樣本里已知的特定生物大分子，也可加入該分子的穩定劑。如果樣本里要保存的生物大分子未定，建議使用更低的溫度儲存。另外目前常見(jiàn)的大型自動(dòng)化樣本存取設備只能和-800C超低溫設備配套使用，尚不能夠和液氮設備配套使用。英國的UK Biobank則是把一部分樣本的拷貝(～950萬(wàn))儲存在-800C做工作樣本，使用自動(dòng)化設備存;另一部分拷貝(～550萬(wàn))在另外一個(gè)地方儲存在液氮氣相中做安全備份，樣本手動(dòng)存取。

　　-1400C樣本儲存

　　-1400C是低于水的玻璃化溫度(～-1360C)，也是液氮氣相和深冷冰箱能夠達到的溫度，樣本在這一溫度范圍內其生物學(xué)活動(dòng)極大降低，是保存樣本中細胞活性的理想溫度。和冰水混合物能維持在00C的相變溫度類(lèi)似，絕緣的液氮容器內液相和氣相氮應該維持在相變溫度-1960C。但實(shí)際上由于液氮容器蓋子不夠密封，從而導致在液氮液面和液氮容器罐口之間形成一個(gè)溫度梯度。美國國家癌癥研究所建議液氮容器口處的溫度應保持在-1400C以下，未來(lái)用途未確定的樣本應以液氮氣相模式儲存，以保護組織內細胞活性。

　　深冷冰箱是電制冷，無(wú)需液氮，裝滿(mǎn)樣品后的穩定溫度通常在-140以下，和使用液氮氣相相比，其優(yōu)勢在于不需頻繁添加液氮，維護方便。但電制冷的降溫速度低于液氮，一旦開(kāi)啟容器取放樣品時(shí)容易造成較大范圍的溫度波動(dòng)，溫度恢復時(shí)間也相對較長(cháng)，因而更適合較少開(kāi)啟取放樣品的情況。另外電制冷冰箱必須保障供電。在斷電情況下推薦使用液氮設備以提供備份儲存。

　　-1960C樣本儲存

　　-1960C是液氮揮發(fā)的溫度，因而只有液氮液相保存技術(shù)能達到此溫度。樣本內的生命活動(dòng)在此溫度下基本停止，樣本的穩定性可以得到長(cháng)期的保存。是長(cháng)期保存樣本內細胞活性、組織器官的復雜結構及活性的最有效方法，得到廣泛認可。與其它不同溫度冷凍模式相比，液氮容器液相儲存樣品需要進(jìn)一步防護樣品間交叉污染。美國國家癌癥研究所推薦使用帶螺旋的凍存管封裝樣本。但在降溫過(guò)程中樣品從超低溫冰箱(-800C)轉移到液氮中時(shí)驟然降溫，引起凍存管帽和管身收縮不一致，容易導致液氮滲入凍存管從而增加了樣品間交叉污染的風(fēng)險。解決的辦法之一是可以使用專(zhuān)門(mén)的凍存管套對每個(gè)凍存管進(jìn)行熱縮密封，或是使用密封膜在凍存管帽與管身接口處纏2-3圈再儲存。前一種方法會(huì )使管身加長(cháng)而需要較高的凍存盒，第二種辦法會(huì )使管身略變粗，推薦使用底部間隔的10x10規格的常規凍存盒。

　　2 冷凍技術(shù)

　　上世紀50-70年代Basil Luyet，James Lovelock，Peter Mazur等學(xué)者針對冷凍對細胞和組織的影響展開(kāi)深入研究，發(fā)現損傷主要來(lái)源于冰晶損傷和溶液滲透壓損傷。隨著(zhù)溫度的下降，細胞內外的水分結冰，所形成的冰晶會(huì )造成細胞膜和細胞壁破壞，從而導致細胞死亡。這種因細胞內部結冰而引起的細胞損傷即冰晶損傷(Intracellular ice damage)。冰晶損傷是由冷卻速度過(guò)快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時(shí)隨著(zhù)溫度的下降，細胞外部的水分會(huì )先結冰，從而使得未結冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，細胞膜上的脂質(zhì)會(huì )因長(cháng)時(shí)問(wèn)暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損壞，細胞發(fā)生脫水滲漏，導致在復溫時(shí)大量水分滲入細胞內造成細胞死亡。這種因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而形成的細胞損傷被稱(chēng)為溶液損傷(Solution damage)。溶液損傷是由冷卻速度過(guò)慢，使細胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間過(guò)長(cháng)而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴重。

　　程序降溫/分步降溫(programmed freezing/stepwise freezing)

　　通過(guò)控制樣本的降溫速度可以盡量減少冰晶損傷和溶液損傷。降溫速度的控制可通過(guò)在不同的溫度下分階段降溫(stepwise freezing)或者程序控制降溫(programmed freezing)實(shí)現。與分步降溫相比，程序降溫儀通過(guò)時(shí)時(shí)調節往凍存空間噴放液氮的流量能更精準地控制樣本本身的降溫速度。比如在0—-50C液體樣本轉變?yōu)楣腆w發(fā)生相變時(shí)會(huì )產(chǎn)生熱量，引起樣本的回溫，造成樣本額外傷害。程序降溫儀能夠在相變時(shí)加大降溫力度避免這一傷害。程序降溫儀在凍存精子、卵子、受精卵、干細胞、皮膚等樣本中得到了廣泛的應用，全球大約有30-40萬(wàn)體外受精的嬰兒使用了這一方法。一個(gè)凍存程序通常包括慢凍、快凍等幾個(gè)階段，在凍存保護劑存在的情況下常見(jiàn)的凍存速度慢凍0.3-1.50C/分鐘,快凍5-80C/分鐘。在0～-400C的區間不少程序使用的是慢凍。但具體的降溫程序隨凍存樣本的不同可能有較大的差別。

　　玻璃化冷凍(Vitrification)

　　玻璃化冷凍的理論首先由Luyet提出。液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列;另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無(wú)序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。 正常冷凍時(shí)水容易在細胞內形成晶體造成晶體損傷，在細胞外形成晶體造成溶液損傷。但在超快速玻璃化冷凍的條件下細胞內外均呈玻璃化凝固，無(wú)冰晶形成或僅形成很小的冰晶，不致對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會(huì )在高濃度的溶質(zhì)中長(cháng)時(shí)間暴露而受損。但玻璃化冷凍所需要的超的高速降溫很難在常規實(shí)驗條件下實(shí)現。1981年Fahy提出用高濃度的冷凍保護液(玻璃化溶液)的方法大大降低了對降溫速度的要求，并與1985年由Rail和Fahy完成鼠胚的玻璃化凍存，實(shí)現這一技術(shù)的使用突破。

　　玻璃化冷凍是一種較新的技術(shù)，適合用于一些常規程序降溫難以處理的樣本，比如復雜的組織和器官。但對于常規程序降溫能夠較好處理的樣本(如細胞和體積很小的組織)，這一技術(shù)還沒(méi)有展現出特別的優(yōu)勢。正常的水的玻璃化冷凍需要極快的速度，是常規實(shí)驗室難以實(shí)現的。為了降低組織的玻璃化降溫要求，需要在樣品中加入高濃度的冷凍保護劑，常用的濃度約在40%～60%(W/V)。即使是幾分鐘的時(shí)間也會(huì )對細胞和組織會(huì )帶來(lái)明顯的傷害。所以雖然玻璃化冷凍減少了冷凍過(guò)程的冰晶傷害和溶液傷害，但在一些對比試驗并沒(méi)有表現出更好的效果，反倒是其復雜的操作帶來(lái)了不便。目前在玻璃化冷凍中，降低冷凍保護劑損傷的方法主要是使用不同冷凍保護劑的混合物和阻冰劑(ice blockers)。通過(guò)這一改進(jìn)，Twenty-First Century Medicine成功將冷凍并化凍的兔腎移植到兔子體內并保持了正常功能。

　　急凍(Snap freezing)

　　急凍法通常用于保護純化的生物大分子，或者為了將來(lái)提取生物大分子的組織樣本。做法是將樣本直接放入液氮中，短時(shí)間處理之后轉移至超低溫冰箱或更低的溫度環(huán)境儲存。比較常見(jiàn)的例子是冷凍用于將來(lái)提取核酸的組織。這種做法會(huì )損傷大部分細胞和精細組織結構，不能用于保存樣本內細胞和組織的活性。

　　3 冷凍保護劑

　　冷凍保護劑是指可以保護細胞和組織微觀(guān)結構免受冷凍損傷的物質(zhì)，通常配成一定濃度的溶液。細胞懸液中加入冷凍保護劑可保護細胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑同溶液中的水分子結合，發(fā)生水合作用，弱化水的結晶過(guò)程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成.同時(shí)冷凍保護劑可以通過(guò)在細胞內外維持一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷。通常只有紅細胞、大多數微生物和極少數有核的哺乳動(dòng)物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡(jiǎn)單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數有核哺乳動(dòng)物細胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護劑的情況下，無(wú)最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～6000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會(huì )死亡;而加入甘油冷凍保護劑進(jìn)行冷凍保存時(shí)，98%以上的細胞都可存活。

　　冷凍保護劑根據其是否穿透細胞膜可分為滲透性和非滲透性?xún)深?lèi)。滲透性冷凍保護劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過(guò)細胞膜滲透到細胞內。該類(lèi)保護劑主要包括二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷同時(shí)，細胞內水分也不會(huì )過(guò)分外滲，避免了細胞過(guò)分脫水皺縮。目前使用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。DMSO對細胞的滲透較快，凍存過(guò)程中保護效果較好，使用比較普遍，常用濃度是5%-10%。但DMSO本身對細胞有明顯的傷害，在40C的溫度下傷害尤甚，因此不建議樣本添加DMSO后在此溫度下長(cháng)時(shí)間放置，通常與程序降溫儀或梯度降溫盒配合使用實(shí)現溫度連續勻速降低。

　　非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說(shuō)很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以?xún)?yōu)先同溶液中水分子結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成;同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。

　　不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。目前的趨勢是聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組合。由于許多冷凍保護劑在低溫條件下保護細胞，在常溫下對細胞有害。故在細胞復溫后要及時(shí)清除冷凍保護劑。