高效液相色譜分析原理及流程

　　高效液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過(guò)程。通常所說(shuō)的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um的吸附劑(硅膠、氧化鋁等)。這種傳統的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡(jiǎn)單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、傳質(zhì)快、柱效高。高效液相色譜法(HPLC)是20世紀60年代后期發(fā)展起來(lái)的一種分析方法。近年來(lái)，在保健食品功效成分、營(yíng)養強化劑、維生素類(lèi)、蛋白質(zhì)的分離測定等應用廣泛。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來(lái)分析測定。

　　高效液相色譜分析原理

　　(一)高效液相色譜分析的流程

　　由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類(lèi)似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

　　(二)高效液相色譜的分離過(guò)程

　　同其他色譜過(guò)程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。開(kāi)始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開(kāi)始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(cháng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A(yíng)，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。

　　不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(cháng)展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。

　　高效液相色譜的類(lèi)型

　　(一)吸附色譜

　　在吸附色譜中，樣品的極性官能團牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團的種類(lèi)、數量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應是能溶解于有機溶劑并是非離子型的，強離子樣品是不適宜的。

　　吸附色譜所使用的流動(dòng)相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能，可進(jìn)一步減小百分數。因為高濃度的醇會(huì )減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，并使重現困難。

　　(二)分配色譜

　　1.正相分配色譜

　　正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機溶劑且帶有極性基團的樣品，但正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。

　　2.反相分配色譜

　　這種方法目前應用非常廣泛，應用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。

　　通過(guò)使用的流動(dòng)相是水—甲醇和水—乙腈，通過(guò)加入甲醇或乙腈的量的不同來(lái)調節分離，但如果樣品帶有離子型基團，需要在流動(dòng)相中加入鹽或調節流動(dòng)相的PH值，例如，如果樣品有一個(gè)—COOH基團，使流動(dòng)相的PH值是偏向酸性的，由于抑制了—COOH基團的電離而加強了保留。這個(gè)方法叫離子抑止法，如果樣品有強離子基，有時(shí)候采用在流動(dòng)相中加入適當抗衡離子以形成離子對的離子對法。

　　在調節PH值中，保持PH值在填料說(shuō)明書(shū)手冊中所規定的范圍內，大多數化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，當加入鹽以后，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能應用非常廣泛的PH值。

　　(三)離子交換色譜

　　這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團和樣品的離子基團之間的離子交換來(lái)分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽(yáng)離子交換和陰離子交換。

　　離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。在離子交換色譜中，流動(dòng)相的鹽的濃度、PH及鹽的種類(lèi)等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因為氯化物會(huì )腐蝕不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用NaCI或其他的氯化物鹽類(lèi)。根據測量波長(cháng)有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當檢測處在短波端的時(shí)候，用醋酸作流動(dòng)相是不合適的。

　　(四)凝膠色譜

　　凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據分子大小用分子篩效應來(lái)分離樣品組分的。這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。

　　因為在樣品中，小尺寸的分子深深地滲透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒(méi)有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹(shù)脂的分離使用有機溶劑作流動(dòng)相，叫做凝膠滲透色譜。

　　凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過(guò)濾。

　　1.凝膠滲透色譜

　　凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography)，簡(jiǎn)稱(chēng)GPC。此一類(lèi)的色譜，使用于有機性溶媒的樣品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脫液有THF，Chloroform等等。

　　2.凝膠過(guò)濾色譜

　　凝膠過(guò)濾色譜(GelFiltrarionChromatography)，簡(jiǎn)稱(chēng)GFC。此一種類(lèi)的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。

　　凝膠的種類(lèi)很多，按其原料來(lái)源可分為有機膠和無(wú)機膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據凝膠的強度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類(lèi)。根據它對溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。