二抗的選擇和定位

　　第一步：選擇抗體。

　　三種二抗抗體：Whole IgG，F(ab&;rsquo;)2片段，Fab片段。

　　Whole IgG抗體適用于多數情況，是性?xún)r(jià)比最高的。Whole IgG是完整的抗體分子，有一個(gè)Fc部分和兩個(gè)與抗原結合的Fab部分 (Figure 1, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc網(wǎng)站)。

　　F(ab&;rsquo;)2片段抗體是胃蛋白酶消化IgG除去Fc部分，剩下靠二硫鍵連接的結合抗原的兩個(gè)Fab部分。F(ab&;rsquo;)2片段抗體用在避免抗體與Protain A 或G結合，或者與有Fc受體的活細胞結合。如果一抗是完整的抗體分子，不管二抗是哪種形式都可能結合Fc受體。

　　Fab片段抗體是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。這些抗體只含有一個(gè)Fab結合位點(diǎn)。它們用來(lái)封閉內源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來(lái)源的一抗多標記的實(shí)驗中封閉暴露的免疫球蛋白。

　　第二步：一抗的物種來(lái)源。

　　為了正確的選擇二抗，必須知道一抗的物種來(lái)源。如果一抗是小鼠來(lái)源的，就找&;ldquo;anti-mouse&;rdquo;。

　　第三步：選擇二抗的物種來(lái)源。

　　第四步：選擇二抗的特異性。

　　因為不同物種來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結構，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應，除非事先特殊處理過(guò)(如標有&;ldquo;min X Hu, Bov&;hellip;Sr Prot&;rdquo; - minimal cross-reactivity to human and bovine serum proteins) ), 經(jīng)過(guò)用圓括號中的物種 (human, bovine) 的血清蛋白的吸附處理來(lái)降低交叉反應)。在選擇二抗時(shí)，只有在來(lái)自?xún)蓚�(gè)很相近的物種的一抗都存在而需要檢測其中一種時(shí)，才使用針對其中一種特殊吸附處理過(guò)的抗體。這樣的抗體可能不能和所有亞型的IgG都很好的反應。比如，在含有內源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，使用針對大鼠吸附處理過(guò)的anti-mouse IgG來(lái)檢測小鼠的一抗，或者在多標記實(shí)驗中使用了大鼠的一抗時(shí)。當不含有大鼠免疫球蛋白時(shí)，最好采用沒(méi)有針對大鼠IgG處理過(guò)的anti-mouse二抗來(lái)檢測小鼠的一抗。牛血清白蛋白(BSA)和奶粉中可能含有牛IgG。直接針對牛，山羊，馬和綿羊的二抗會(huì )跟牛IgG反應。因此，使用BSA或者奶粉來(lái)封閉或者稀釋這些抗體可能導致背景染色明顯增加，以及抗體效價(jià)的降低。這時(shí)，推薦使用5%的二抗來(lái)源物種的正常血清來(lái)封閉。

　　Anti-IgG (H+L)這類(lèi)抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈[比如Fc和F(ab&;rsquo;)2/Fab部分]都可以反應。也可以和其他的免疫球蛋白家族(比如IgM和IgA)反應，因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈(&;kappa;鏈或者&;lambda;鏈)。Anti-IgG (H+L) 比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位。

　　Anti-IgG，Fc fragment specific這類(lèi)抗體和IgG重鏈的Fc部分反應。它們通過(guò)了ELISA檢測，和(或)針對Fab片段吸附的測試。某些情況下，需要額外檢測和處理來(lái)降低和IgM或IgA的交叉反應，會(huì )被描述為&;ldquo;Anti-IgG, Fc&;gamma;fragment specific&;rdquo;。注意：不是所有anti-IgG, Fc抗體和所有亞型的IgG反應能力一致。要找和四種IgG亞類(lèi)反應能力差不多的anti-mouse IgG, Fc&;gamma;抗體的話(huà)，應當選Goat Anti-Mouse IgG (subclasses 1+2a+2b+3), Fc&;gamma;fragment specific (min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)。

　　Anti-IgG，Fc&;gamma; Subclass specific抗體分別和不同的小鼠IgG亞型重鏈的Fc部分反應。這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)ELISA和/或針對Fab片段、IgM和其他小鼠IgG亞型的吸附測試。

　　Anti-IgG，F(ab&;rsquo;)2 fragment specific和IgG的F(ab&;rsquo;)2/Fab部分反應。這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)了ELISA和/或Fc片段的吸附檢測。因為和輕鏈反應，它們同時(shí)也和具有相同輕鏈的其他種類(lèi)的免疫球蛋白反應(如IgM和IgA)。

　　(min X&;hellip;Sr Prot)這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)了檢測，以及針對IgG和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。當其他物種免疫球蛋白的出現可能導致交叉反應時(shí)，推薦使用這類(lèi)抗體。但是，當要選擇經(jīng)過(guò)針對相近物種吸附處理的抗體時(shí)，要特別注意，因為它們能識別的表位數量大大減小了，可能識別單抗的能力很弱。這種情況的例子有Anti-Mouse IgG (min X Rat,&;hellip;.Sr Prot), Anti-Rat IgG (min X Mouse, &;hellip;Sr Prot), 和 Anti-Ramenian Hamster IgG (min X Mouse, Rat, &;hellip;Sr Prot)。

　　ML (Multiple Labeling多標記實(shí)驗): 有些抗體標明了ML，來(lái)強調它們除了可以用于單標，還可用于多標記實(shí)驗。

　　第五步：選擇需要的探針。

　　第六步：選擇的抗體的規格、價(jià)錢(qián)和目錄號。