高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)和常見(jiàn)問(wèn)題

　　高效液相色譜(HighPe-rformanceLiauidChromatography，HPLC)的主要優(yōu)點(diǎn)是：⑴分辯率高于其它色譜法⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成;⑶重復性高;⑷高效相色譜柱可反復使用;(5)自動(dòng)化操作，分析精確度高。根據分離過(guò)程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個(gè)基本類(lèi)型，即液-固色譜、液-液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物;⑵有機酸;⑶甾體化合物;⑷生物鹼;⑸抗菌素;⑹糖類(lèi);⑺卟啉;⑻核酸及其降解產(chǎn)物;⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽;⑽脂類(lèi)等。高效液相色譜的常見(jiàn)問(wèn)題有：

　　1、渦流擴散(Eddydiffusion)

　　流動(dòng)相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細溝，則流動(dòng)相的速度就快;有的部位結塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴散小，柱效率高。

　　2、分子擴散(Moleculardiffusion)

　　分子擴散就是物質(zhì)分子由濃度高的區域向濃度低的區域運動(dòng)，也稱(chēng)縱向分子擴散。要減少分子擴散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時(shí)在操作時(shí)，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時(shí)間長(cháng)，則擴散嚴重。

　　3、質(zhì)量轉移(Masstransfer)

　　被分離物質(zhì)要在流動(dòng)相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個(gè)液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時(shí)間。當流速快時(shí)，轉移速度慢，來(lái)不及達到平衡動(dòng)相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動(dòng)，使區帶變寬。

　　4、動(dòng)相流速

　　當流速太低時(shí)，分子擴散嚴重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當達到最低值時(shí)，流速再加大則質(zhì)量轉移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過(guò)濾色譜中，因為物質(zhì)要滲透到凝膠內部，所以質(zhì)量轉移影響大，流速咖大會(huì )降低柱效率。

　　5、固定相顆粒大小

　　定相顆粒越小柱效率越高，對流動(dòng)相流動(dòng)的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動(dòng)。