生物顯微鏡在做免疫實(shí)驗時(shí)的注意要點(diǎn)

　　在進(jìn)行免疫標記時(shí)，通常先將種屬特異IgG分子生物索化，顯微鏡并制備生物素或抗生物素蛋白與標記物的復合物，生物顯微鏡利用生物素與抗生物素蛋白間的高親和性反應識別抗原位置。顯微鏡下面是標記物與抗生物素蛋白結合時(shí)免疫標記模式圖。

　　此時(shí)，生物顯微鏡二抗不是通過(guò)化學(xué)交連而是通過(guò)免疫學(xué)反應與標記物偶連。圖6-3是此法的模式圖。利用不標記抗體作為橋分子的主要優(yōu)點(diǎn)是避免了化學(xué)交連對抗體活性可能產(chǎn)生的影響。PAP (Per-oxidase - A nt iperoxidase)法和鐵蛋白一抗鐵蛋白法均屬此例。

　　顯微鏡隨著(zhù)研究對象(組織、細胞、順粒)，生物顯微鏡抗原部位(細胞內，細胞表面，鑲嵌于膜內)和觀(guān)察方法(透射電鏡、掃描電鏡)的不同，顯微鏡免疫標記的具體過(guò)程也各不相同。本節將介紹兩種基本的免疫標記方法一包埋前法與包埋后法。

　　顯微鏡樣品產(chǎn)生非特異結合的另一個(gè)來(lái)源是Fc受體。掃描電鏡在巨噬細胞，B-淋巴細胞，嗜中性粒細胞和單核細胞表面均有Fc受體.研究這些細胞的表面抗原時(shí)最好使用Fab或F (ab’):代替完整抗體分子，顯微鏡以避免F。生物顯微鏡段與Fc受體的結合。

　　抗體不純或效價(jià)太低都可能造成非特異結合。顯微鏡免疫標記時(shí)應使用經(jīng)過(guò)純化的高效價(jià)抗體。生物顯微鏡方法學(xué)不當是造成非特異結合的顯微鏡最常見(jiàn)的原因.具體說(shuō)來(lái)有下面幾種可能:

　　(1)樣品中的靜電荷未封閉或封閉不全，由于靜電相互作用抗體結合于樣品。顯微鏡在標記前，樣品用1%BSA處理以及在一抗和二抗稀釋液中加入1 %BSA都是為了封閉樣品中的電荷。生物顯微鏡如果效果不佳，顯微鏡可試用0. 5 yo雞蛋清蛋白或二抗種屬的正常(顯微鏡未經(jīng)免疫的)血清(10%)或脫脂奶粉((200"4%)代替BSA.

　　(2)經(jīng)醛類(lèi)固定后樣品中游離醛基未封閉。生物顯微鏡醛類(lèi)固定后，掃描電鏡樣品經(jīng)0.5mo1/L NH,CI處理是免疫電鏡樣品制備的必要步驟。顯微鏡有時(shí)也可用0.05mol/L的賴(lài)氨酸或甘氨酸代替NH,C1.