氣相色譜和液相色譜微型化中的關(guān)鍵問(wèn)題

　　在色譜儀器微型化過(guò)程中,尺寸的縮小不僅要考慮材料的性質(zhì)和制造上的可能,還要從原理上考慮尺寸縮小后所帶來(lái)的一系列問(wèn)題。這些問(wèn)題包括:(1)分離系統中被分配的分子個(gè)數是否大于106,因為只有大于106才能得到符合統計結果的數據;(2)因分離通道尺寸縮小,自然提高了單位柱長(cháng)的效率,但是總長(cháng)度的減少可能使總分離效能遠低于常規儀器;(3)對于質(zhì)量敏感型檢測器,經(jīng)過(guò)分離柱后單位時(shí)間內到達檢測器的分子個(gè)數是否滿(mǎn)足檢測原理所要求的最小數目; (4)對于濃度型檢測器,到達檢測池的分子數目是否能滿(mǎn)足符合統計規律的分子數目;(5)檢測微區內的外加能量密度是否超過(guò)被檢測分子所能承受的極限; (6)微量流動(dòng)相的輸送與控制;(7)因材料尺寸的縮小,表面層氧化或腐蝕對器件功能的影響。最后,色譜儀器微型化所帶來(lái)的好處不僅僅是單位長(cháng)度分離效率的提高,而是總分離能力的保持甚至提高;不僅僅是分離系統或某個(gè)部件的微型化,而是整體的微型化;不僅僅是質(zhì)量靈敏度的提高,而是濃度靈敏度的保持或提高;不僅僅是能量和物質(zhì)的低消耗,而是使用的方便和友好;不僅僅是整體尺寸的縮小,更重要的是整機的穩定性和可靠性的提高!

　　下面分別討論上述7個(gè)問(wèn)題。

　　(1)色譜分離的基本原理是有符合統計規律數目的分子群經(jīng)過(guò)不斷的兩相分配和分子碰撞,利用其分配系數的差異來(lái)達到分離的目的。這是一個(gè)宏觀(guān)參數。當分子數目低于這個(gè)數目時(shí),就會(huì )偏離統計規律而出現所謂的漲落現象。分子數目越少,漲落現象越嚴重。當分子數目低于103個(gè)時(shí),已沒(méi)有準確的色譜保留規律,因此也就失去了宏觀(guān)意義下的分離規律。一般地,保證符合統計規律的分子數目是106個(gè)。

　　例如內徑30μm的填充毛細管液相色譜 (μ2HPLC)柱或毛細管電泳柱,若分別保持10萬(wàn)/m和40萬(wàn)/m的分離柱效,直接進(jìn)樣時(shí)不過(guò)載的進(jìn)樣量分別為40pL(1pL=10-12L)和 115pL,分子總數分別是112×1012～112×1014和415×1010～415×1012。樣品中含量低至1～0.01μL/L(對 μ2HPLC)或低至20～0.2μL/L(對CE)的組分就不能滿(mǎn)足106個(gè)分子的數目要求,分離過(guò)程中就會(huì )出現上述問(wèn)題。所以,上述分離系統對濃度高于這個(gè)指標的樣品分離時(shí)可以有重復的保留時(shí)間。如果考慮檢測方面的限制[參見(jiàn)下述的(3)和(4)>,痕量分析中用粗內徑的填充色譜柱總是優(yōu)于微型色譜柱。

　　為了能進(jìn)行痕量分析,微型分離分析系統往往采用樣品預濃縮技術(shù)以補償濃度靈敏度的不足。但為此而發(fā)展的技術(shù)也同樣適用于常規分離分析系統,同樣可以提高常規儀器的靈敏度,除非樣品量受到嚴格限制。

　　(2)45年前的色譜柱理論已經(jīng)指出,毛細管開(kāi)口柱的內徑越小,或填充柱的填料粒度越小,色譜柱的分離效率就越高。毛細管電泳亦然,只是理論上有些不同,如有散熱問(wèn)題和塞子流型的特點(diǎn)。微型化中普遍采用的細內徑分離柱并不是微型儀器的專(zhuān)利,所能達到的高柱效也不是最近才認識到的。如果在現有常規儀器中使用這種等效內徑的色譜柱,再適當改進(jìn)進(jìn)樣技術(shù)和檢測器,就會(huì )有與微型色譜或芯片電泳同樣的單位柱長(cháng)的柱效,同時(shí)還可以有極高的總分離效能,因為常規儀器中分離柱的長(cháng)度很少受限,而高的分離效能才是真正有意義的。所以,微型色譜和芯片毛細管電泳用短分離柱而有快速分離的特點(diǎn),并不是它真正的優(yōu)點(diǎn),因為用同樣尺寸的分離柱可以分別在常規色譜和毛細管電泳上實(shí)現同樣的效果。用現有的思維模式來(lái)進(jìn)行的色譜儀器微型化,導致了使用短分離柱,而且所有的應用例子都是用極簡(jiǎn)單的樣品,這是因為這樣的微型化儀器的總分離效能太低。

　　(3)質(zhì)量型檢測器的響應值與單位時(shí)間內進(jìn)入檢測器的樣品分子數成正比。分離柱的樣品容量與柱內徑的3次方(毛細管開(kāi)口柱)或平方(填充柱)成正比。例如氣相色譜FID檢測器,用內徑50μm的毛細管柱只能分析樣品中含量為011%(1000ppm)以上的組分;而用內徑530μm的毛細管柱能分析樣品中含量為3×10-7(013ppm)以上濃度的組分,相差3000 倍。雖然細內徑色譜柱的譜帶寬度(表現為色譜峰寬度)比粗內徑色譜柱的窄,能增加單位時(shí)間內的分子數目,但它是與柱徑的平方根(本質(zhì)上是柱效的平方根關(guān)系)成正比;與柱容量的減少比,仍然虧215次方。離子化檢測器和熒光檢測器都是質(zhì)量型的,離子化效率一般在10-5～10-3,熒光產(chǎn)率一般在 10-3,所以單位時(shí)間內進(jìn)入檢測器的分子數目必須大于50×103～50×105,具體數值取決于檢測器的性能。用濃度型檢測器會(huì )極大地改善這種

　　狀況,因為響應值主要與目標組分的濃度有關(guān),特殊的質(zhì)量型檢測器,如具有單分子檢測能力的激光誘導熒光檢測器和熱透鏡檢測器等,已用于CE和μ2HPLC。但是他們絕對不是微型化的設備,也不是一臺色譜儀或電泳儀的價(jià)格所能買(mǎi)到的。在痕量分析中,用直接進(jìn)樣方式和質(zhì)量型檢測器時(shí),常規色譜總是優(yōu)于微型色譜。

　　(4)從宏觀(guān)上講,濃度型檢測器的響應值與進(jìn)入檢測池內樣品分子的總數無(wú)關(guān),而只與樣品分子和流動(dòng)相分子數的比值有關(guān)。例如,用50μm和530μm內徑的毛細管柱和池體積為012μL的熱導檢測器(μ2TCD)檢測,最小檢出濃度分別為2×10-5(體積分數)和2×10-6(體積分數),僅差10 倍。而后者單位時(shí)間內進(jìn)入檢測池中的分子數目比前者多3×103倍。所以微型色譜和微型流動(dòng)分析儀器中用濃度型檢測器有利。但是這個(gè)理論是有限度的。如在 CE和μ2HPLC中,當分離柱內徑≤75μm、塔板高度≤10μm時(shí),要求檢測池體積在nL級(10-8～10-9L),用吸收光譜檢測器(濃度型檢測器)時(shí),上述理論不再成立。因為從微觀(guān)看,檢測的原理是利用樣品分子的某種特性,當分子數目不滿(mǎn)足檢測原理所要求的統計數目時(shí),表現為噪聲信號。所以在上述的微型分離系統中,最小檢出濃度是很高的,遠不如常規分離系統的低。

　　就檢測器本身而言,微型化會(huì )影響它的響應靈敏度。如氣相色譜用的熱導檢測器,由于給定氣體的熱導率與通道的壁間距(d)有關(guān),特別是在d≤015mm時(shí),熱導率隨d的減小而呈幾何增加,因此微型化使熱導檢測器的靈敏度有大幅度提高。所以,微型化研究應選擇那些在原理上有利于保持或提高靈敏度的檢測器,或者研究那些有極高檢測靈敏度的檢測器微型化問(wèn)題,如激光誘導熒光檢測器。

　　(5)檢測微區內的外加能量問(wèn)題。任何檢測原理和技術(shù)都是依賴(lài)樣品分子與外加能量的相互作用而產(chǎn)生的物理信號。由于檢測微區達到μm級,而作用到微區的光或電磁波強度往往比常規檢測器高幾倍到幾萬(wàn)倍,以此彌補因樣品分子數減少而損失的信號2噪聲比值。例如,吸收光譜檢測器或熒光光譜檢測器等常規檢測器的光斑直徑在500～1000μm,而μ2HPLC或μ2CE的檢測器光斑直徑僅有30μm,甚至5μm,但所用的光源功率往往是相同的,經(jīng)過(guò)聚焦,達到檢測區的光強度提高了3個(gè)數量級甚至更高。在這樣小的微區內,如此高的光強度會(huì )產(chǎn)生如下問(wèn)題:液體汽化、熒光物質(zhì)“漂白”、被檢測分子變性、響應非線(xiàn)性等。

　　(6)微量流動(dòng)相的輸送與控制。在儀器的微型化中,因為氣相色譜的載氣流量以 10mL/min到011mL/min計,液相色譜流動(dòng)相流量以50μL/min到0105μL/min計。特別是液相色譜儀的微流量輸液泵,更是微型化的關(guān)鍵難題。用分流的方法解決用常規裝置實(shí)現微流量調控只是權宜之計;同樣,通過(guò)改裝常規檢測器來(lái)適應微型儀器也是很牽強的。例如,由于動(dòng)態(tài)密封的微滲漏,現有的機械/電子式氣體流量控制閥幾乎不能對1mL/min的流量有1%的控制精度;現有的液相高壓輸液系統也不能對015μL/min的流量有3% 的控制精度。而上述精度都是微型色譜儀所需要的。所以,只有從原理上、材料上、技術(shù)工藝上和工程上都重新研究和設計,才能有真正意義上的微型化。

　　(7)因所用材料質(zhì)量的微小,表面層氧化或腐蝕對器件功能的影響遠大于常規色譜儀器。例如熱導檢測器(TCD)中的敏感熱絲,常規的直徑在100μm, 而微型化的熱敏層厚度僅有幾個(gè)μm甚至1μm,所以必須解決熱敏層老化或腐蝕的難題。再比如微型化的電化學(xué)檢測器,電極厚度在10-1μm量級,而常規的在102μm量級,兩者相差幾百倍。所以,微型化的器件必須解決耐腐蝕和老化問(wèn)題,才能成為實(shí)用化的器件,而不僅僅是展品或樣機。

　　此外,對于二維分離系統,分離效率決不是簡(jiǎn)單的第1根柱效(N1)×第2根柱效(N2),而是與柱的選擇性有直接關(guān)系。當某一對組分在其中一維上不能達到徹底分離時(shí),往往在另一維上的分離度也為零。所以真正有意義的二維分離系統必須是:同系列化合物的目標組分對必須在某一維上達到徹底分離,而不同維擔當分離不同族化合物的任務(wù)。

　　在設計構思上,微型化不僅是簡(jiǎn)單尺寸的縮小,其本質(zhì)上的進(jìn)步是在解決原理性難題的過(guò)程中不斷的創(chuàng )新。

　　不論從科學(xué)上還是實(shí)用上,片面追求分離系統的微小化而忽視檢測靈敏度和檢測濃度范圍的問(wèn)題;追求單位柱長(cháng)分離效率的提高和快速檢測而忽視實(shí)際樣品分離對總柱效的要求;追求進(jìn)樣區和分離柱的微小化而忽視其可操作性和檢測設備的微型化,是目前微型化研究的誤區。從戰略上講,整體微型化的難點(diǎn)問(wèn)題是分析化學(xué)微型化發(fā)展的基本難題,雖然有時(shí)解決這些問(wèn)題不是分析化學(xué)學(xué)科領(lǐng)域的事,但是因為其他學(xué)科沒(méi)有遇到這類(lèi)問(wèn)題,致使這些問(wèn)題成為游離于所有學(xué)科的、但是又需要多學(xué)科交叉才能解決的科學(xué)和技術(shù)難題。所以,微型化不是簡(jiǎn)單的分析化學(xué)問(wèn)題,而是分析化學(xué)與材料學(xué)、流體力學(xué)、電磁學(xué)、微加工技術(shù)和工藝、電子學(xué)、生化和有機化學(xué)等學(xué)科的交叉,是能夠在本質(zhì)上推動(dòng)分析化學(xué)發(fā)展的年輕的學(xué)科。