顯微鏡使用調試

　　在了解了顯微鏡各主要部件的名稱(chēng)、構造和功能之后，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率，保證在顯微觀(guān)察及顯微照像過(guò)程中取得最佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調試方法和使用方法。尤其在新一代顯微鏡中，具備了多種功能，能進(jìn)行多種顯微鏡檢方法觀(guān)察，正確的試調方法和使用方法就顯得尤為重要。下面以萬(wàn)能研究顯微鏡為例，簡(jiǎn)述調試及使用方法。

　　1. 顯微鏡照明光路系統的調整

　　為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調試時(shí)，就必須把照明光路系統調整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可*結果的重要手段和最基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統的調整，是使用顯微鏡過(guò)程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過(guò)程中不時(shí)地檢驗顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統的調整主要有以下4項內容：

　　(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調整

　�、� 首先將燈室的外殼打開(kāi)，壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中，安裝時(shí)避免手指直接接觸燈泡(可用柔軟的布或紙隔住)，以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。

　�、� 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專(zhuān)用的螺絲刀調節燈的調焦旋鈕孔(標有“←→”)，使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調至清晰;然后調節燈的高低位置調節絲孔(標有“──”)，使燈絲位置高低適當;再調節燈的左右位置調節螺絲孔(標有“──”)，使燈絲左右位置合適。

　　(2) 光源發(fā)光體(燈絲)在顯微鏡內位置的檢驗和校正　目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調入物鏡的視域范圍內，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調整庫勒照明系統的前提條件。需要的基本工具：對中望遠鏡購置顯微鏡時(shí)已配備。

　�、� 拔掉燈庫內的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上;

　�、� 選用10×物鏡，開(kāi)亮光源程序找樣品并調焦清晰，再換用40×物鏡把樣品調焦清 晰(40×物鏡可以看清燈絲的全貌);

　�、� 把聚光鏡的孔徑光闌和視場(chǎng)光闌均開(kāi)到最大;

　�、� 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對中望遠鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像;

　�、� 如燈絲位置不合適，調“──”孔，把燈絲像沿水平方向調好，調“──”孔，把絲像沿垂直方向調好，直至將燈絲像調至剛好充滿(mǎn)物鏡孔徑的光圓像;

　�、� 調整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對中望遠鏡，換回目鏡作下一步調整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調整和光源發(fā)光體在顯微鏡內位置的校驗，只需在顯微鏡初次安裝調試及更換燈泡時(shí)進(jìn)行，平時(shí)使用顯微鏡時(shí)不能隨意亂調亂動(dòng)。萬(wàn)一調亂時(shí)，可按上述步驟調回原狀。

　　(3) 庫勒照明(Kohler)系統的正確調整　顯微鏡的正確調試，主要工作之一是照明光路系統的調整，而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統的調整。對于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來(lái)說(shuō)，應該對庫勒照明系統的原理及其調整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應有的功能，拍出來(lái)的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫勒照明系統的原理簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是：光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來(lái)，在顯微鏡的視域中就實(shí)現了非常充分而又均勻的照明。調整庫勒照明系統的目的，是為了使所觀(guān)察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統造成影響或干擾，以免照像時(shí)在底片形成灰霧。高調整庫勒照明系統的必要部件：視場(chǎng)光闌、可進(jìn)行合軸調整的聚光鏡系統。

　�、� 選用10×物鏡和10×目鏡;

　�、� 把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調至適中的位置上(不大不小)，再把聚光鏡升到最頂的位置上，聚光鏡轉盤(pán)調至明視野“J”位置;

　�、� 把視場(chǎng)光闌調至最小(0.1);

　�、� 載物臺上放上已封片的生物樣品，開(kāi)亮光源，調焦清晰;

　�、� 視域中會(huì )出現一個(gè)局部照明的區域或亮斑，這是視場(chǎng)光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細節;在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細節看得清楚;

　�、� 把聚光鏡微微地向下調，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個(gè)清晰的多邊形象，這便是視場(chǎng)光闌的清晰像;

　�、� 一般情況下，多邊形象并不在視域中央，需要調整聚光鏡的一對調中螺絲，把視場(chǎng)光闌多邊形的像調至中央位置;

　�、� 逐漸開(kāi)大視場(chǎng)光闌，使多邊形象成為視域的內接多邊形，進(jìn)一步核對調中的狀況，如對中不夠理想，繼續微微調對中螺絲;

　�、� 將視場(chǎng)光闌稍為再微微開(kāi)大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫勒照明系統調整完畢。 庫勒照明系統調整好以后，整個(gè)視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過(guò)程中應特別注意： a. 視場(chǎng)光闌不可任意開(kāi)大，但可隨物鏡倍數的增大而將視場(chǎng)光闌收小，隨物鏡倍數的減小而開(kāi)大; b. 聚光鏡的高低位置不準亂調，否則會(huì )破壞已調整好的庫勒照明系統; c. 使用10×以下物鏡時(shí)要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時(shí)要將前端透鏡擺入光路中; d. 關(guān)于物鏡倍數與視場(chǎng)光闌大小配合問(wèn)題，在實(shí)際使用過(guò)程中，作為一般觀(guān)察不一定要收小或開(kāi)大視場(chǎng)光闌，但作顯微照相時(shí)，為了避免雜散光線(xiàn)對照相系統的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應在使用每一個(gè)倍數的物鏡時(shí)，把視場(chǎng)光闌調節到正好消失于所觀(guān)察的視域邊上，這是比較繁復的工作，但又非做不可。較為簡(jiǎn)便的方法是把與各個(gè)倍數物鏡相對應的視場(chǎng)光闌事先調整好，并作好記號，以后使用時(shí)根據記號直接調至相應的位置。

　　(4) 孔徑光闌的正確使用　由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時(shí)應掌握正確的使用方法。過(guò)去由于對孔徑光闌的認識不足，往往把它當作是調節視野亮度的工具。雖然調節孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會(huì )直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過(guò)程中應盡可能避免。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀(guān)察時(shí)，尤其在作顯微照相時(shí)獲得最佳分辨率，在每換用一個(gè)倍數的物鏡時(shí)，在樣品調焦清晰后，需要調節孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數值孔徑(物鏡孔徑像)的2/3 。 調整方法是用對中望遠鏡對焦于視野中黑色相差環(huán)上，調節孔徑光闌，可以看到一個(gè)多邊形的孔徑光闌像，然后調到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內之間。為方便起見(jiàn)，可把與各倍數物鏡相對應的孔徑光闌預先調整好，并作好標記，以免每次使用都要重新調整。

　　2. 顯微鏡成像光路系統的調整及顯微鏡檢術(shù)概要　顯微鏡成像光路系統的調整，是根據不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)(microscopy)，概括而言就是以顯微鏡觀(guān)察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡(jiǎn)述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路系統的調整方法。

　　(1) 透射光明視野(brightfield)　這是自顯微鏡發(fā)明以來(lái)最傳統、最普遍的應用方法�；�本部件： a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀(guān)察; b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。調整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統調整好后，即可應用明視野法。 適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。 注意事項： a. 使用明視野方法觀(guān)察時(shí)，一定要將庫勒照明系統調整好; b. 視場(chǎng)光闌不可任意開(kāi)大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中; c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調節視野的亮度，更不要亂調聚光鏡的高低位置，否則，會(huì )降低顯微鏡的分辨率和破壞已調整好的庫勒照明系統; d. 作顯微照相時(shí)，每換用一個(gè)倍數的物鏡，就要調節聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數值孔徑的2/3 。

　　(2) 透射光相差法(phase-contrast)　這是現代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強法�；�本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。 調整方法： a. 在庫勒照明系統調整好的基礎上，用明視野方法把樣品調焦清晰; b. 把聚光鏡轉到Ph1對準轉盤(pán)刻度線(xiàn)位置，選用10×相差物鏡，換上待觀(guān)察的透明樣品; c. 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對中望遠鏡，并調焦于視野中的兩個(gè)相差環(huán)上(物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)); d. 視野中的兩個(gè)相差環(huán)不一定重合，調節聚光鏡上的兩個(gè)調節裝置(調整相差環(huán)左右位置的調節桿和調整前后位置的摩擦式轉鈕)，使透光環(huán)作前后左右移動(dòng)而與黑環(huán)重合; e. 調整好后，換回觀(guān)察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀(guān)察到樣品的相差像; f. 有20×和40×物鏡觀(guān)察時(shí)，聚光鏡應設在Ph2位置上，用100物鏡時(shí)，聚光鏡應設在Ph3位置上。 適用范圍：適用于觀(guān)察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

　　(3) 微分干涉相襯法(differential interference-contrast，DIC)　為了克服相差法觀(guān)察時(shí)樣品細節像周?chē)�伴隨有光暈，會(huì )掩沒(méi)掉本來(lái)應該看見(jiàn)的細節，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設計子微分干涉相襯法。 調整方法 a. 必須在庫勒明系統已調好的基礎上才能調好DIC方法; b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調焦位置; c. 把起偏器(polarizer)擺入照明光路中，注意其取向應為東—西方向; d. 把聚光鏡轉盤(pán)轉到與10×物鏡對應使用的位置上，即DIC 0.3—0.4; e. 在物鏡后方或物鏡轉換器上插入10×物鏡使用的DIC插片(DIC slider); f. 把檢偏器(analyser)插入成像光路中，注意其取向應為南—北方; g. 換上待觀(guān)察的透明樣品，開(kāi)亮光源把樣品調焦清晰; h. 調節DIC插片，使微分干涉相襯的像達到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯; i. 同時(shí)可調節聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達到最佳; j. 然后再細微調樣品的細節，可見(jiàn)樣品中不同層面上的結構; k. 如果把補色器(first order red retardation plate)插入，并同時(shí)調節DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達100?m左右，培養中的活組織和活細胞、小生生物等。

　　(4) 落射光激發(fā)的熒光法(incident-loght fluorescence Epi-FL)　簡(jiǎn)稱(chēng)為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來(lái)的一種強有力的反差增強法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀(guān)察。該方法較簡(jiǎn)便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。 熒光方法是利用波長(cháng)較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長(cháng)較長(cháng)的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長(cháng)的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì )有特定的波長(cháng)，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱(chēng)為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會(huì )吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱(chēng)為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用于醫學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。調整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調整的方法大致相同。

　�、� 汞燈的安裝 a. 打開(kāi)包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時(shí)注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側或右側; b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線(xiàn)另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定; c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應的螺絲，再把燈座上的連線(xiàn)和插座插到汞燈電源后部專(zhuān)用的插座上。 d. 詳細的安裝方法請參照有關(guān)說(shuō)明書(shū)。

　�、� 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調整： a. 接通汞燈電源，讓汞燈預熱10-15min; b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線(xiàn)對地高度一樣的水平線(xiàn)作為參考線(xiàn); c. 轉動(dòng)燈室調焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上; d. 分別調節燈室外殼上的5個(gè)調節螺絲孔，把汞弧的像其反射像調成并排且盡量*近，但不要重疊在一起。

　�、� 汞燈汞弧在顯微鏡內位置的檢驗： a. 將汞燈照明光路系統中的視場(chǎng)光闌開(kāi)到最大; b. 把熒光濾光片組推到藍光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼; c. 把觀(guān)察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙; d. 取下一個(gè)物鏡，使激發(fā)的藍光經(jīng)物鏡轉換器的空檔照在白紙上，白紙上會(huì )有一藍色的圓形照明區域，汞弧的像及其反射像都應該出現在這區域的中央部位，否則，可調節燈室調焦旋鈕至最清晰，然后分別調節燈室外殼上的5個(gè)調節螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區域的中央位置。 e. 調好之后，把物鏡裝回去，通過(guò)目鏡可見(jiàn)白紙被藍光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光; f. 仔細調焦，可看清白紙的纖維;取去白紙，樣品上的熒光細節隱約可見(jiàn)而很容易調焦清晰。

　�、� 汞燈使用注意事項　目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內通有一對鎢電極和液態(tài)汞(室溫下附在管壁上)，未點(diǎn)燃時(shí)，管內氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強光，溫度升高，管內氣壓迅速升到10個(gè)大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。 a. 汞燈接通電源后需要10-15min預熱時(shí)間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩定的激發(fā)光。因此，觀(guān)察前要提早通電; b. 汞燈在使用過(guò)程中，不要隨意開(kāi)關(guān)汞燈的電源; c. 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規定時(shí)，將會(huì )造成嚴重后果! 由于汞燈內的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內形成強大的電流，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個(gè)實(shí)驗室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會(huì )炸毀燈室內的集光-聚光部件。 d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當可達600h，使用壽命與開(kāi)關(guān)的次數成反比，應集中一批樣呂作2-3h的觀(guān)察。汞燈價(jià)格及昂貴，應珍惜使用。 e. 汞燈壽命終結的標志是點(diǎn)燃困難，燈管發(fā)黑。 5. 暗視野法(dark field)　許多透明或半透明的樣品，如細菌、微生物、細胞內的精細結構及結晶體的內含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細節。普遍光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為0.2?m，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節構造分辨不清楚，但卻可看到0.004?m以上微細顆粒的存在，即可以看到亞顯微結構，特別適合用來(lái)觀(guān)察微細的顆粒與細菌等。 調整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時(shí)須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統調整好。換上暗視野聚光鏡時(shí)，要把載玻片(樣品)移開(kāi)，將浸沒(méi)油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺上，浸沒(méi)油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過(guò)光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進(jìn)入聚光鏡內。對于配備齊全的相差顯微鏡，與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。