高效液相色譜法測定石杉堿甲的含量

　　昆明石杉HuperziakunmingensisChing.系石杉科石杉屬植物，為我國特有種，主要分布于云南、貴州等地，生于灌木下、苔蘚叢中[1]。20世紀80年代，我國科學(xué)工作者從同屬植物蛇足石杉中分離到石杉堿甲(Hup-A)，并闡明它是一種可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，對治療重癥肌無(wú)力、記憶力減退和早老年癡呆具有較好的效果[2，3]，現已被廣泛應用于臨床。為了科學(xué)、合理地利用石杉屬植物資源，本實(shí)驗首次采用HPLC法對昆明石杉中石杉堿甲的含量進(jìn)行測定，為尋找和篩選石杉堿甲新的植物資源提供科學(xué)依據。

　　1儀器與試藥

　　HPLC色譜儀(帶四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測器等);電子分析天平;KQ50B超聲清洗器;電熱恒溫水浴鍋;石杉堿甲對照品，批號：100243-200401);乙腈(色譜純);二次重蒸水;其他試劑均為分析純。

　　實(shí)驗藥材采至貴州黔東南，由貴州科學(xué)院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉H.kunmingensisChing.，標本存放于貴陽(yáng)中醫學(xué)院民族醫藥研究所，標本憑證(20056)。

　　2方法與結果

　　2.1色譜條件ZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)，檢測波長(cháng)為310nm，流速1ml·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣量為5μl。在此色譜條件下，樣品中的石杉堿甲與其他峰能達到基線(xiàn)分離，其理論塔板數為4656，對稱(chēng)因子為0.92。石杉堿甲的保留時(shí)間為11.15min，對照品與樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

　　2.2樣品的制備

　　精密稱(chēng)取實(shí)驗藥材細粉2g于500ml的圓底燒瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，棄去濾液。濾渣再用95%的甲醇提取3次，合并濾液并回收溶劑，加入2%的酒石酸溶解，用氨水調節pH值至8.0，再用氯仿萃取至Dragendorffors反應呈陰性，揮干有機溶劑，用無(wú)水乙醇溶解并定容至25ml即得。

　　2.3線(xiàn)性關(guān)系的考察

　　精密稱(chēng)取石杉堿甲對照品2.40mg于25ml容量瓶中以無(wú)水乙醇溶解并定容，得濃度為0.096mg·ml-1對照品溶液，再分別稀釋成0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的對照品供試液，在色譜條件下測定。以進(jìn)樣濃度對峰面積進(jìn)行回歸，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995�？芍�石杉堿甲在0.015～0.48μg之間與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

　　2.4精密度實(shí)驗取石杉堿甲對照溶液，在色譜條件下重復進(jìn)樣6次，結果石杉堿甲峰面積的RSD為0.36%(n=6)。

　　2.5穩定性實(shí)驗取供試品溶液，每隔2h測定1次，考察石杉堿甲的含量變化，結果含量的RSD為0.85%(n=6)，表明供試品在10h內穩定。

　　2.6重復性實(shí)驗精密稱(chēng)樣品6份，按“2.2”項的要求制備6份供試液，在色譜條件下分別進(jìn)行測定，結果Hup-A含量的RSD為0.60%(n=6)。

　　2.7回收率實(shí)驗精密稱(chēng)取昆明石杉藥材細粉6份，每份1g，分別加入對照品供試液(0.003mg·ml-1)100ml，按樣品制備方法和色譜條件，制備加樣回收供試液進(jìn)行測定，計算回收率(見(jiàn)表1)。結果石杉堿甲的平均回收率為99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉堿甲加樣回收率實(shí)驗結果(略)

　　2.8樣品的測定

　　按“2.2”項的要求精密稱(chēng)取樣品3份，制備供試液，按色譜條件進(jìn)行測定，重復3次，取平均值，石杉堿甲在原植物中的平均含量為0.03%。

　　3討論

　　首次采用HPLC法測定昆明石杉中石杉堿甲的含量。

　　測定方法是在其它石杉中石杉堿甲含量測定[4，5]方法的基礎上，改用ZORBAXSB-C18色譜柱及以0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)為流動(dòng)相。實(shí)驗證明該方法易行、靈敏、準確、可靠。

　　在同科屬植物中，昆明石杉是石杉堿甲含量相對較高的一個(gè)植物品種，達到0.03%。