結晶紫法檢測TNF的生物活性

　　TNF包括TNFα與TNFß兩型，它們具有極其相似的生物學(xué)活性，在體內外可對一些腫瘤細胞或細胞系起殺傷作用，而對正常細胞則無(wú)細胞毒效應。根據這一特點(diǎn)，可利用TNF對敏感靶細胞的細胞毒效應，在體外檢測TNF的活性水平，既可檢測分泌型TNF(sTNF)，也可檢測膜結合型TNF(mTNF)。最常用的方法是體外檢測TNF對小鼠成纖維瘤細胞(L929細胞)的細胞毒效應。

　　【基本原理】

　　TNF對L929細胞有細胞毒作用，如同時(shí)加用轉錄抑制劑放線(xiàn)菌素D，則可提高L929細胞對TNF的敏感性10～100倍。利用染料結晶紫或MTT可使活細胞染色，再用脫色液將染料脫出，測定其OD值，即可反應細胞的存活狀態(tài)或TNF對L929細胞的殺傷率，通過(guò)計算細胞死亡率，并與sTNF標準品對照，即可檢測待測樣品sTNF活性單位。

　　【材料和試劑】

　　(1)L929細胞株(存活率應>95%)

　　(2)TNF標準品：作倍比稀釋(100U/ml～0.1U/ml)。

　　(3)待測樣品：作倍比稀釋至少6個(gè)不同稀釋度。

　　(4)0.25%胰蛋白酶

　　(5)RPMI-1640培養液及PBS

　　(6)0.25%結晶紫(溶于20%甲醇中)，或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)

　　(7)放線(xiàn)菌素D(分存液濃度為100ug/ml)

　　(8)檸檬酸鈉緩沖液(0.9%檸檬酸鈉，0.02mol/L鹽酸，47.5%乙醇，為脫色液);酸化異丙醇(0.04mol/LHCL異丙醇)

　　(9)96孔細胞培養板，刻度吸管，毛細吸管，加樣器(頭)，刻度離心管，離心機，細胞計數板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養箱。

　　(10)酶標測定儀，570nm濾光片，630nm濾光片。

　　【操作步驟】

　　(1)取對數生長(cháng)期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細胞2次，以去除消化液及原生長(cháng)培養液;

　　(2)用RPMI-1640培養液調L929細胞濃度為2×105/ml;

　　(3)將上述細胞懸液加至96孔培養板，100ul/孔;

　　(4)置37℃，5%CO2培養箱中培養24h;

　　(5)吸去細胞培養上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標準品和待測樣品，100ul/孔，各設雙復孔，并設培養液陰性對照及空白對照(即L929細胞、標準品及待測樣品均不加入，僅加培養液);

　　(6)同時(shí)向各孔均加入10ul放線(xiàn)菌素D(0.5～1μg/孔);

　　(7)置37℃，5%CO2培養箱中培養12-14h;

　　(8)甩棄上清，并用RPMI-1640培養液洗細胞1次;

　　(9)每孔均加入0.25%結晶紫，100μl/孔，室溫下染色10min;

　　(10)甩棄上清，再用PBS洗板3次;

　　(11)室溫下涼干，加入檸檬酸鈉緩沖液脫色，100μl/孔;

　　(12)充分混勻后，用酶標儀以檢測波長(cháng)570nm，參考波長(cháng)630nm測各孔OD值。