雜質(zhì)蛋白鑒定與定量的完美結合-Hi3分析方法

　　液質(zhì)數據中，不但含有蛋白藥序列表達是否正確的肽圖信息，其它雜質(zhì)蛋白同樣可以被挖掘出來(lái)。然而，單純的雜質(zhì)蛋白鑒定卻又是不夠遠遠的，其確切的含量信息同樣至關(guān)重要。沃特世PLGS軟件可以在肽圖液質(zhì)數據中，進(jìn)一步鑒定其中的雜質(zhì)蛋白，并其相對含量信息進(jìn)行分析。

　　一、“順便”完成的雜質(zhì)蛋白鑒定與相對定量

　　使用相應的開(kāi)放數據庫，PLGS軟件首先根據液質(zhì)數據中的離子碎片信息對多肽進(jìn)行鑒定，進(jìn)而組裝出樣品中的所有蛋白，完成蛋白鑒定步驟。在蛋白相對含量測定中，PLGS軟件充分利用了MSE全信息串聯(lián)質(zhì)譜方法的數據優(yōu)點(diǎn)。較DDA方法，MSE數據的離子色譜峰近乎“完美”，更加符合實(shí)際多肽色譜峰型。通過(guò)全面研究發(fā)現，MSE數據中的多肽色譜峰強度信息，與蛋白濃度相關(guān)性非常好。使用每個(gè)蛋白鑒定多肽中，強度前三的多肽峰強度加和值，即表征其蛋白濃度。因此，使用PLGS分析同一個(gè)肽圖液質(zhì)數據，便可“順便”完成雜質(zhì)蛋白的鑒定與相對定量工作。

　　二、蛋白絕對含量測定

　　如果想得到樣品中準確的蛋白絕對濃度信息，也非常簡(jiǎn)單。只需在樣品中加入一個(gè)已知的蛋白內標便可。這時(shí)Hi3分析方法會(huì )根據內標蛋白的濃度，按照以下公式，對樣品中的絕對濃度進(jìn)行定量。

　　三、使用Hi3方法分析殘留宿主細胞蛋白(HCP)

　　融合抗體anti-phosphotyrosine IgG 1 (PTG1 mAb)使用中國倉鼠卵巢細胞系DG-44 CHO在兩種培養條件下表達，表達后的PTG1 mAb再分別使用A、B兩種方法純化。經(jīng)過(guò)2D-UPLC MSE方法采集液質(zhì)數據后，使用PLGS軟件分析[3]。在分析結果中，可以明確地給出鑒定到樣品中含有的雜質(zhì)蛋白，以及給出這些雜質(zhì)蛋白的相對含量結果(圖1)。為了驗證Hi3定量方法的可靠性，使用MRM方法對以上實(shí)驗結果中Clusterin、Elongation factor 1-alpha、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase三個(gè)蛋白進(jìn)行了定量驗證。通過(guò)Hi3與MRM兩種定量方法結果對比，可以發(fā)現兩者定量濃度非常接近(圖2)。在使用PLGS進(jìn)行樣品中的雜質(zhì)蛋白鑒定與定量分析中，檢索方法設置與肽圖分析幾乎一致，只增加將參考蛋白的名稱(chēng)與濃度列入分析參數一步。之后，所有的分析過(guò)程都將由PLGS自行完成，并直接給出蛋白鑒定身份與濃度的結果列表。實(shí)際上PLGS不僅使用在生物藥雜質(zhì)蛋白分析中，在樣品極為復雜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，Hi3方法已經(jīng)被長(cháng)期使用。