熒光PCR的分析方法

　　對熒光定量PCR結果的分析方法我們分為兩種：絕對定量分析法和相對定量分析法。

　　1、絕對定量分析方法，起始濃度的對數跟循環(huán)數的線(xiàn)性關(guān)系，標準曲線(xiàn)由已知拷貝數的標準品繪制，根據樣品的Ct值，可求樣品的模板量。

　　(1)標準品的制備：

　　1V的樣品原液(i)+9V稀釋緩沖液，得到ii;

　　1V的ii +9V稀釋緩沖液，得到iii;

　　1V的iii + 9V稀釋緩沖液，得到iv;

　　1V的iv +9V稀釋緩沖液，得到v。

　　(2)拷貝數的計算：待測樣本濃度(ng/ul)=OD260×40*稀釋倍數

　　樣品分子量+堿基數×324

　　待測樣本拷貝數=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014

　　從擴增數據得到循環(huán)數，通過(guò)標準曲線(xiàn)，我們可以求出樣品的拷貝數。

　　2.相對定量分析方法：

　　其又可有雙標準曲線(xiàn)法和雙Ct法。所謂相對，就只是實(shí)驗前后結果的對比，反映了反應前后的數據的差值。

　　(1)雙標準曲線(xiàn)法，分析簡(jiǎn)單，但是對于每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗都需要做標準曲線(xiàn)，而且必須有特定的標準品作標準曲線(xiàn)，這樣的標準品不代表樣品擴增的真實(shí)狀態(tài)。這種方法常用于基因表達調控。

　　F=待測樣品目的基因濃度/待測樣品參照基因濃度÷對照樣品目的基因濃度/對照樣品參照基因濃度

　　(2)雙Ct法，此方法不用對看家基因和目的基因做標準曲線(xiàn)，而只需要對待測樣品分別進(jìn)行PCR擴增即可，標準曲線(xiàn)的差值<0.1.假若擴增效率為100%或標準曲線(xiàn)及每次擴增之間的效率都保持一致，這樣實(shí)驗條件優(yōu)化較難為復雜。這種分析方法較長(cháng)用于基因表達調控研究中。