反相高效液相色譜負峰測定法研究以及酮類(lèi)的測定

　　【摘要】研究了反相液相色譜中負峰現象及產(chǎn)生的原理，應用計量置換作用原理解釋了樣品在色譜柱中的計量置換保留行為;應用負峰法測試了甲基脂肪酮各組分的含量。本研究采用AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水,含0.01mmol/L磺基水楊酸)=60∶40，紫外檢測器(λsig=310nm，λref=275nm)。本方法簡(jiǎn)便，線(xiàn)性相關(guān)系數r均大于0.9993;甲基酮的定量下限為0.041μg;相對標準偏差為0.52%～0.80%。

　　【關(guān)鍵詞】反相高效液相色譜;負峰法;計量置換;甲基酮

　　1引言

　　反相液相色譜中負峰測定法是一種間接光度檢測方法，廣泛應用于離子色譜和毛細管電泳中，檢測對象基本是離子型化合物[1～5]，對于其作用機理也有相關(guān)解釋[3～5]。而由于缺乏合理的理論解釋?zhuān)�間接光度反相液相色譜未得到很好的應用。色譜計量置換機理[6]即一個(gè)溶質(zhì)分子被吸附劑吸附的同時(shí)，必伴隨著(zhù)一定計量數目的溶劑分子離開(kāi)溶質(zhì)分子與吸附劑的界面而返回到溶液中。這個(gè)理論很好地解釋了間接光度反相液相色譜測定中出現的負峰現象。若應用紫外檢測器，樣品分子是無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收的分子，流動(dòng)相含有紫外吸收分子，則在色譜分離過(guò)程中樣品分子與固定相上吸附的紫外吸收分子發(fā)生置換使其返回到流動(dòng)相中，相應譜帶的紫外吸收分子濃度降低，檢測器檢測出負峰(即弱吸收峰)信號。因此，負峰法使紫外檢測器可應用于無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收的物質(zhì)的分析測定。醛酮分子在紫外區有很微弱的吸收，用紫外檢測器一般很難直接測定。通常，醛酮的測定需利用氨化還原反應在其還原端接上有紫外吸收的基團，例如2,4�捕�硝基苯肼衍生測定法[7,8]。若能借鑒色譜中的計量置換機理，采用間接光度技術(shù)直接測定醛酮，則可消除衍生化操作帶來(lái)的麻煩和誤差。文獻[9]應用負峰測定法測定乙酸酯，文獻[5]報道了間接光度色譜法，但用計量置換機理解釋反相液相色譜溶質(zhì)溶劑作用關(guān)系，及負峰法測定酮類(lèi)物質(zhì)尚未見(jiàn)報道。

　　本實(shí)驗在流動(dòng)相中加入吸光物質(zhì)作為本底試劑，用負峰法測定甲基脂肪酮類(lèi)化合物，系統研究了色譜分析條件。本實(shí)驗用計量置換作用機理解釋了反相液相色譜測定中出現的負峰現象。研究表明，在液相色譜分析時(shí)紫外檢測器也可用于無(wú)紫外吸收物質(zhì)的測定。

　　2實(shí)驗部分

　　2.1儀器與試劑

　　HP1100液相色譜儀(美國惠普公司)，配DAD二極管陣列檢測器、HPChemstation化學(xué)工作站、AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)。

　　甲醇(色譜純，FisherScientific公司);丙酮(天津市富于精細化工有限公司);丁酮(天津化學(xué)試劑六廠(chǎng));甲基異丙基甲酮(上海試劑一廠(chǎng));甲基異丁基甲酮、對苯二酚(西安化學(xué)試劑廠(chǎng));水楊酸(新中化學(xué)廠(chǎng));磺基水楊酸(廣州化學(xué)試劑廠(chǎng));N,N�捕�甲基乙酰胺(成都市聯(lián)合化工試劑研究所)，上述試劑均為分析純，實(shí)驗用水為二次蒸餾水。

　　2.2實(shí)驗方法

　　用含確定量本底試劑的流動(dòng)相平衡儀器至基線(xiàn)平直，在選定色譜條件下，對樣品進(jìn)行分析。

　　3結果與討論

　　3.1流動(dòng)相的選擇

　　實(shí)驗中采用二元流動(dòng)相，向流動(dòng)相中加入適量的本底試劑，在流動(dòng)相中甲醇與本底試劑水溶液的體積比分別為70∶30，60∶40，50∶50，40∶60和30∶70，對甲基酮系列樣品混合溶液進(jìn)行測定。實(shí)驗表明，當V(甲醇)∶V(本底試劑水溶液)=60∶40時(shí)，各組分能達到很好地分離，而且分析時(shí)間短。因此本實(shí)驗采用V(甲醇)∶V(本底試劑水溶液)=60∶40為流動(dòng)相進(jìn)行樣品測定。

　　3.2本底試劑的選擇

　　基于本底試劑的化學(xué)性質(zhì)和極性，本實(shí)驗考察了對苯二酚、水楊酸、磺基水楊酸、N,N�捕�甲基甲酰胺作為本底試劑時(shí)，甲基酮的檢出限和儀器平衡時(shí)間�；腔�水楊酸的極性較強，平衡時(shí)間短，而且檢出限低，結果如表1所示。本實(shí)驗最終以磺基水楊酸為本底試劑。表1本底試劑與平衡時(shí)間和最低檢測量的關(guān)系(略)

　　3.3負峰產(chǎn)生機理及檢測波長(cháng)的選擇

　　實(shí)驗向流動(dòng)相中加入磺基水楊酸作為強紫外吸收的本底試劑，用這種流動(dòng)相平衡儀器至基線(xiàn)平直。因為待分析樣品甲基脂肪酮是弱紫外吸收物質(zhì)，所以當樣品進(jìn)樣后，甲基酮分子把原來(lái)吸附在固定相上的部分流動(dòng)相分子(包括甲醇、水和加入的本底試劑分子)置換出來(lái)，使得固定相上對應甲基酮分子譜帶的磺基水楊酸濃度低于其它分子譜帶。由于此方法檢測的吸光度為磺基水楊酸濃度變化的凈吸光度，因此流出色譜柱經(jīng)過(guò)檢測器時(shí)測得比基線(xiàn)小的吸光度，紫外檢測器檢測出負峰信號。

　　本實(shí)驗以甲基酮的吸收波長(cháng)275nm作為參比波長(cháng)，改變檢測波長(cháng)對樣品進(jìn)行測定。實(shí)驗發(fā)現，基線(xiàn)噪音和信噪比隨檢測波長(cháng)而變化，噪音小，信噪比大，檢測靈敏度高。

　　如圖1和圖2所示，檢測波長(cháng)高于260nm噪音較小且無(wú)明顯變化;310nm時(shí)信噪比最大。實(shí)驗選擇的本底試劑為磺基水楊酸，經(jīng)測定其最大吸收波長(cháng)為296nm，而樣品的最大吸收波長(cháng)在275nm附近。如果選擇檢測波長(cháng)為296nm，樣品信號峰最大，但噪音略大，則信噪比較小。由于實(shí)驗測定的是本底試劑吸光度的減少值，磺基水楊酸最大吸收波長(cháng)296nm靠近樣品的最大吸收波長(cháng)，而310nm距其相對較遠，所以檢測波長(cháng)為310nm時(shí)，ΔA較296nm時(shí)略大，信噪比也較大。因此實(shí)驗選擇310nm為檢測波長(cháng)。此時(shí)噪音小，信噪比大，靈敏度高。

　　3.4本底試劑濃度的選擇

　　將本底物質(zhì)加入流動(dòng)相中，會(huì )使得基線(xiàn)噪音增大，所以選擇本底試劑的濃度應盡可能低;但如果其濃度太低，將降低檢測的靈敏度。本實(shí)驗分別配制本底試劑濃度0.005，0.01，0.02和0.05mmol/L的流動(dòng)相，平衡儀器至基線(xiàn)平直，進(jìn)行實(shí)驗。由圖3所示，基線(xiàn)噪音隨本底物質(zhì)濃度變化較大，且當本底物質(zhì)濃度為0.01mmol/L時(shí)，噪音最小，最小檢測量最低。所以，確定流動(dòng)相中所加的磺基水楊酸的濃度為0.01mmol/L。

　　3.5甲基酮系列分離

　　準確量取丙酮、丁酮、甲基異丙基甲酮和甲基異丁基甲酮各100μL于10mL容量瓶中，用本底試劑濃度為0.01mmol/L的流動(dòng)相作為溶劑加至刻度，搖勻。取10μL此甲基酮混合溶液進(jìn)樣進(jìn)行色譜分離(圖4)，分離結果良好，以上各物質(zhì)的分離度均大于1.5，峰形良好。

　　3.6線(xiàn)性關(guān)系、精密度和檢出限

　　峰面積和進(jìn)樣量成正比，是色譜定量分析的依據。本方法是根據色譜過(guò)程樣品組分對本底試劑的置換作用建立的，測定的是負峰，為考察負峰面積與進(jìn)樣量間的關(guān)系，在本文選定的色譜條件下，取上述甲基酮溶液分別進(jìn)樣2，4，6，8和10μL。將所測得的峰面積與對應酮的絕對量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，丙酮、丁酮、甲基異丙基甲酮、甲基異丁基甲酮的峰面積A與其絕對進(jìn)樣量x的工作曲線(xiàn)分別為：A=226.19x-123.62，A=230.24x-98.855，A=218.65x-110.01，A=179.63x-45.128，線(xiàn)性相關(guān)系數r分別為0.9993，0.9995，0.9997，0.9996。因此，此方法可以準確進(jìn)行定量分析。

　　準確吸取10μL上述甲基酮溶液進(jìn)行平行測定，結果見(jiàn)表2。采用逐步稀釋測定信噪比為3∶1時(shí)，甲基酮的定量下限為0.041μg。表2混合樣品測定結果(略)

　　4結論

　　色譜負峰測定法反映了物質(zhì)在色譜分離過(guò)程中存在一定的計量置換作用，從實(shí)驗上支持了計量置換理論;從研究所采用的技術(shù)可見(jiàn)，用HPLC紫外檢測器可用于測定無(wú)紫外吸收的物質(zhì)，擴大了紫外檢測器的應用范圍;分析中直接檢測的是加入的本底試劑的吸光度減少值，因此，只要能確定待測物質(zhì)與加入物質(zhì)的計量關(guān)系，即可在沒(méi)用標準樣品的情況下定量分析樣品。