PCR儀常見(jiàn)問(wèn)題及回答

　　1. cDNA產(chǎn)量的很低

　　可能的原因：

　　*RNA模板質(zhì)量低

　　*對mRNA濃度估計過(guò)高

　　*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足

　　*同位素磷32過(guò)期

　　*反應體積過(guò)大，不應超過(guò)50μl

　　2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺

　　*最常見(jiàn)的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系

　　*與反應起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)

　　*建議在試驗中加入對照RNA

　　*第一鏈的反應產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，在總的反應體系中的含量不要超過(guò)1/10

　　*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環(huán)狀結果，有可能導致GSP無(wú)法與模板退火;或SSⅡ反轉錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。

　　*目的mRNA中含有強的轉錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：

　　a. 將第一鏈的反應溫度提高至50℃。

　　b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應。

　　3. 產(chǎn)生非特異性條帶

　　*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

　　*在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chǎn)生。

　　*由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結果。

　　4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶

　　*在PCR反應體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高

　　*減少引物的用量

　　*優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數

　　*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增，一般會(huì )顯示為彌散背景。

　　5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

　　*大多數情況下是由于退火溫度過(guò)低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

　　*對于長(cháng)片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)

　　6. 在無(wú)反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果

　　*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進(jìn)行體外轉錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

　　*有可能是引物二聚體的條帶

　　7. 擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

　　*有可能是由于模板量過(guò)高而導致PCR結果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴增。

　　*另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

　　8. SSⅢ與SSⅡ有何不同?

　　*具有更高的熱穩定性(達50℃)

　　*具有更長(cháng)的半衰期(達220分鐘)

　　*對PCR無(wú)抑制

　　*干冰運輸

　　*Tdt活性更低

　　9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript?

　　ThermoScript如果保存不當會(huì )引起活性很快降低，SSⅢ則更穩定。

　　10. 為什么使用基因特異性引物(GSP)?

　　GSP在擴增低豐度的轉錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(cháng)轉錄本的逆轉錄;隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。

　　11. 什么情況下需要使用RNase H?

　　在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)

　　12. 根據不同的目的選擇不同的系統：

　　目的 建議

　　RT與PCR使用不同的引物

　　或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統

　　高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統

　　高特異性 含有適當的DNA聚合酶的兩步法RT-PCR系統

　　或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統

　　高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統

　　長(cháng)的反轉錄結果 通常使用兩步法RT-PCR系統可達到最佳結果

　　含Elongase酶的一步法RT-PCR系統

　　二、Generacer

　　1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物(GSP)?

　　使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：

　　*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)

　　*23-28個(gè)堿基長(cháng)度，以提高引物特異性

　　*降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至最低

　　2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?

　　*加入Hela對照

　　*低質(zhì)量的RNA模板

　　*逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(cháng)模板cDNA的合成

　　*目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數來(lái)解決，建議使用巢式PCR

　　*目的基因沒(méi)有表達，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因

　　*目的基因太長(cháng)而不適合進(jìn)行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(cháng)cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。

　　*cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應參數及反應體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區;使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應。

　　3. RACE的PCR結果有雜帶

　　RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　*GSP與其他cDNA的非特異性結合會(huì )導致在擴增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。

　　*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會(huì )導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　*RNA降解。

　　*PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因為沒(méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來(lái)確定。

　　4. 得不到全長(cháng)的5’RACE PCR產(chǎn)物

　　*CIP反應后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。

　　*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。

　　*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

　　二、Generacer

　　1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物(GSP)?

　　使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：

　　*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)

　　*23-28個(gè)堿基長(cháng)度，以提高引物特異性

　　*降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至最低

　　2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?

　　*加入Hela對照

　　*低質(zhì)量的RNA模板

　　*逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(cháng)模板cDNA的合成

　　*目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數來(lái)解決，建議使用巢式PCR

　　*目的基因沒(méi)有表達，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因

　　*目的基因太長(cháng)而不適合進(jìn)行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(cháng)cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。

　　*cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應參數及反應體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區;使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應。

　　3. RACE的PCR結果有雜帶

　　RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　*GSP與其他cDNA的非特異性結合會(huì )導致在擴增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。

　　*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會(huì )導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　*RNA降解。

　　*PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因為沒(méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來(lái)確定。

　　4. 得不到全長(cháng)的5’RACE PCR產(chǎn)物

　　*CIP反應后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。

　　*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。

　　*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

　　三、PCR

　　在進(jìn)行PCR時(shí)：

　　*請確保您沒(méi)有使用過(guò)量的起始DNA或者過(guò)高濃度的引物，也沒(méi)有加入過(guò)量的Mg++

　　*請確保您使用了恰當的退火溫度

　　*請確保您沒(méi)有使用過(guò)量的DNA聚合酶

　　四、引物

　　1. 應該選擇哪種純化方法?

　　取決于實(shí)驗目的和引物的長(cháng)度

　　2. 為什么我訂購了50nmol，但是收到卻只有40nmol?

　　50nmol是起始量

　　3. 怎樣制備100μM的儲液?

　　體積(μl)=質(zhì)檢報告上的nmol數目×10

　　4. 怎樣設計引物?

　　*一般長(cháng)度20-30bp;

　　*至少50%的GC含量;

　　*避免引物二聚體和二級結構;

　　*引物對的Tm值應該接近。

　　5. 引物序列有插入或缺失?

　　*使用上游和下游引物多測幾個(gè)克隆。

　　*請選擇正確的純化方法。

　　6. PCR無(wú)結果?

　　*請檢查引物設計是否正確;

　　*請檢測OD讀數是否正確;

　　*做一個(gè)陽(yáng)性對照和一個(gè)陰性對照