流式細胞術(shù)及其臨床應用
[2011/9/23]
流式細胞術(shù)(flowcytometry FCM)是對單個(gè)細胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析和分選的一門(mén)技術(shù)。在分析或分選過(guò)程中，包繞在流動(dòng)液體中處理過(guò)的單個(gè)細胞或微粒通過(guò)聚焦的光源，產(chǎn)生電信號，這些信號代表光散射、熒光等參數，以此測定出細胞或微粒的物理和化學(xué)性質(zhì)，并可根據這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，以對其進(jìn)一步的培養或分析。包繞細胞的液流稱(chēng)為鞘液。所用儀器稱(chēng)為流式細胞儀(flowcytometer FCM)。流式細胞術(shù)綜合了光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、免疫學(xué)、激光技術(shù)和計算機科學(xué)等多門(mén)學(xué)科和技術(shù)，具有檢測速度快、精確、測量指標多、采集數據量大、分析全面、方法靈活等特點(diǎn)。
一、流式細胞儀(flowcytometer FCM)
1.流式細胞儀的基本結構
流式細胞儀的結構一般可分四部分。
(1)流動(dòng)系統
流動(dòng)系統是流式細胞儀的心臟，因為細胞懸液在被檢測之前必須首先形成一個(gè)很細的穩流，細胞在其內部排成單列通過(guò)測量區。細胞懸液和鞘液分別(是分別還是同時(shí))進(jìn)入流動(dòng)室，鞘液的作用是使樣品懸液中的粒子組成單一縱列方式通過(guò)測量區，保證每個(gè)細胞通過(guò)激光照射區的時(shí)間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。
(2)激光系統
多采用氬離子激光器。使發(fā)射光在可見(jiàn)光譜范圍內488nm激發(fā)。目前市場(chǎng)上大多數熒光色素適用于此波長(cháng)。激光的單色性好，功率高，穩定。
(3)光學(xué)和電子系統
激光束射至經(jīng)流體力學(xué)聚焦的個(gè)別細胞和粒子后，光散射在各個(gè)方向(360?)發(fā)射。有兩個(gè)光散射參數需收集，前向角散射(FSC)主要用于檢測細胞體積的大小。
另一為側向散射(SSC)用于檢測細胞膜，胞質(zhì)，核膜等細胞內部結構及胞質(zhì)內顆粒。
熒光信號是由對細胞進(jìn)行染色的特異性熒光染料受到激光激發(fā)后發(fā)射的。熒光波長(cháng)與激光波長(cháng)不同，而且強度較弱，因此要使用光學(xué)濾片濾除非熒光信號并使用靈敏的檢測器。熒光測量時(shí)通常使用線(xiàn)性放大器(即放大器的輸出與輸入是線(xiàn)性關(guān)系)，適用于較小范圍內變化的信號，如前向角散射和DNA測量。但有時(shí)需要對數放大器(即輸出與輸入是對數關(guān)系)。如果原來(lái)輸出為1，當輸入增加到原來(lái)的10倍時(shí)，輸出是2。在免疫學(xué)檢測中常使用對數放大器，因為在免疫學(xué)的樣品中，可能有的細胞未被染色而僅有自發(fā)熒光，為陰性群體;被染上色的細胞特異性熒光可能比自發(fā)熒光強數倍到數十倍，為陽(yáng)性群體。使用對數放大器可以同時(shí)分辨出亮度差異大的多個(gè)細胞亞群，容易選定不同亞群間的分界點(diǎn)，有利于流式細胞儀的分析和分選。
熒光信號的補償：當用一種激光束同時(shí)激發(fā)兩種染料發(fā)射出兩種不同波長(cháng)的熒光時(shí)，兩種熒光發(fā)射光譜有一定的重迭，可用電補償減去不適合熒光通道測定的重迭信號。
(4)數據貯存和計算機控制系統
數據貯存采用列表排隊(List Mode)方式。利用計算機用多種圖形來(lái)表明各參數間的相互關(guān)系，以單參數直方圖，雙參數二維點(diǎn)圖，等高圖等方式顯示。數據分析一般設定正確的分析范圍，劃分計算區域和計算結果。
(5)細胞分選系統
細胞分選可使被指定的細胞從細胞群體中分離出來(lái)。流式細胞儀所測定的任何參數都可以作為細胞分選依據，被選出來(lái)的細胞的均一性與所測參數有關(guān)。其工作原理是把液滴形成信號在壓電晶體上使之產(chǎn)生機械振動(dòng)(不太通順)，液柱斷裂成一連串均勻的液滴，一部分液滴中包有細胞，如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細胞特性相符，則帶有特定的電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，偏轉落入指定的收集器內，完成細胞分類(lèi)收集的目的。
2.流式細胞儀的類(lèi)型
流式細胞儀分為兩大類(lèi)，一類(lèi)為臨床分析型(又名臺式機)，特點(diǎn)為儀器光路調節系統固定，自動(dòng)化程度高，易學(xué)易掌握。如Becton Dickinson(簡(jiǎn)稱(chēng)BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等;另一類(lèi)為科研(分選)型，特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細胞分選出來(lái)，并且將單個(gè)或指定個(gè)數的細胞分選到特定的培養孔或板上，同時(shí)可選配多種波長(cháng)類(lèi)型的激光器，適用于更廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。最近BD公司推出了FACSAria,其優(yōu)點(diǎn)為具備科研分選型標準而操作與臨床分析型同樣簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高。
3.流式細胞儀檢測的質(zhì)量控制
(1)樣品與試劑
血液、骨髓、體液等必須當天采集，6 h之內進(jìn)行免疫熒光染色;活化血小板檢測應在采血后立即染色與固定。組織樣品可采用機械法去聚集并過(guò)濾，最好用單細胞制備儀(medimachine)處理。試劑、緩沖液、溶血劑、固定劑等必須符合標準。
(2)對照設置
目的是避免各種因素可能造成的假陽(yáng)性或假陰性反應。
�、偻蛯φ眨号c單克隆抗體(MoAb)相同的、未免疫小鼠標記熒光素的免疫球蛋白亞類(lèi)作對照。主要考慮細胞的自發(fā)熒光、非特異性抗體結合等影響因素。
�、陉�(yáng)性對照：已知陽(yáng)性標本能否確定為陽(yáng)性。達不到要求時(shí)不能進(jìn)行臨床試驗。
�、坳幮詫φ眨河靡阎槐磉_某種抗原的細胞作樣品檢測，應出現陰性。目的是避免實(shí)驗的非特異性反應。
�、苷φ眨簩σ环N新的MoAb，在使用前進(jìn)行對照試驗，可保證儀器在最佳條件下獲取樣品。
�、葙|(zhì)控品：
試劑廠(chǎng)方提供與待測樣品成分相近的穩定的質(zhì)控物，并提供檢測項目的靶值和質(zhì)控范圍，作為某一試驗項目的全程質(zhì)量檢測物，評估試驗結果的可靠性。如BDMulti-Check Control 是淋巴細胞及其亞群分析的全血質(zhì)控品。
(3)儀器的校準與性能檢測
使用標準熒光微球，運行FACSComp軟件，校準通過(guò)，表明儀器狀況良好。
二、流式細胞儀的功能和臨床應用
流式細胞儀最大的貢獻在于促進(jìn)了免疫學(xué)基礎研究和臨床診斷。目前流式細胞術(shù)已被廣泛用于細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)和臨床檢驗等多學(xué)科領(lǐng)域的基礎和臨床研究。
1.流式細胞儀的功能
(1)細胞參量分析
包括細胞大小、形狀、蛋白熒光、氧化還原狀態(tài)，膜的結構、流動(dòng)性、微粘度、膜電位，酶活性，鈣離子含量，pH值，染色質(zhì)結構，DNA合成，堿基比例等。
(2)細胞表型分析
從1982年正式以CD(clustor of differentiation) 來(lái)表達(示)白細胞分化抗原。己確定的CD序號從CDl一CD247，這些細胞表面分化抗原，可以將人體組織細胞分為T(mén)細胞、B細胞、髓樣細胞、血小板、NK細胞、粘附分子、內皮細胞，細胞因子受體/趨化性細胞因子受體、干細胞/祖細胞、碳水化合物/凝集素、 非譜系組共13系。CD抗原在細胞表面的獲得和丟失在一定程度上反映細胞分化程度和功能狀態(tài)。研究CD的意義在于①理解CD抗原分子本身的一些特性及其與免疫功能的關(guān)系;②認識和探討CD抗原所表達細胞的功能及其在疾病發(fā)生中的作用。
(3)細胞分選
這是FCM的一項重要功能，目前FCM對細胞亞群的分選純度可以達到99%，除了對特定的亞群加以分選外，還可以分出所需要的染色體加以分析甚至能結合PCR方法加以擴增，這多用于研究中。
2.流式細胞儀檢測在臨床的應用
流式細胞儀的功能決定了其在醫學(xué)領(lǐng)域的重要地位，目前在臨床上主要用于細胞表型分析、造血系腫瘤診斷和分型、移植前配型及與免疫有關(guān)疾病分析等。
(1)CD抗原與白細胞分析
�、賂細胞
CD3+(注意下面CD分子的格式應一致)：成熟T淋巴細胞，是鑒定T細胞的重要標志，判斷細胞免疫狀況。
CD4+： T輔助/誘導細胞亞群
CD8+： T抑制/細胞毒亞群
CD4+ /CD8+比值：是免疫狀態(tài)標志的檢測指標，正常CD4+ /CD8+比值為1.2∽2.9,在腫瘤、免疫缺陷病、病毒感染、自身免疫病、器官移植后都有診斷、預后和治療的指導價(jià)值，其比例降低與病變程度有關(guān)。
CD8+ /CD28+ 與CD8+ /CD28—：前者為細胞毒T細胞(Tc)，后者為抑制性T細胞(Ts)。
CD4+/CD25+ 與CD4+ /CD25—：前者為免疫調節性T細胞，后者為效應T細胞。
CD4+ /CD29+：輔助性誘導細胞，輔助B細胞產(chǎn)生抗體和誘導細胞介導的淋巴細胞溶解作用，自身免疫性疾病可見(jiàn)增多。
CD4+ /CD 45RA+ 與CD4+ /CD 45Ro+：前者為原初細胞(naive cell)主要功能是誘導Ts細胞活化和輔助其功能活性。SLE、MS患者外周血CD4+ /CD 45RA+細胞減少，后者為記憶細胞(memory cell)。
�、贐淋巴細胞：CD19+是總的B淋巴細胞特異抗原，判斷體液免疫狀況。CD23+為IgE低親和力受體，分布于B淋巴細胞、嗜酸粒細胞上，增多與變態(tài)反應性疾病、腎病綜合癥、白血病等有關(guān)。
�、跱K淋巴細胞： CD3—/CD(16+56)+ 細胞表型。
�、軉魏�/巨噬細胞標志：CD14+細胞
(2)CD 抗原與血小板分析
分析單個(gè)血小板或血小板亞群膜糖蛋白，是血小板膜糖蛋白檢測分析方法學(xué)上的重大發(fā)展，對先天性與獲得性血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，尤其是評價(jià)血栓性疾病與血栓前狀態(tài)發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中血小板的活化程度及其診斷、治療、預防等具有特別重要的意義。FCM分析血小板膜糖蛋白方法簡(jiǎn)便、快速、標本用量少、靈敏度高、特異性強、結果準確，為血小板的基礎和臨床研究提供了嶄新的手段。
CD62p(P選擇素)是一種糖蛋白，存在于血小板α顆粒以及內皮細胞中。CD62p在體內或體外刺激后，即轉移至膜表面，巨核細胞也有表達。CD62p又稱(chēng)GMP—140或PADGEM蛋白(血小板活化依賴(lài)α顆粒膜蛋白)，它在血小板與單核細胞及中性粒細胞相互作用中起關(guān)鍵作用。
CD63為溶酶體膜糖蛋白，在多種細胞的表面和胞漿內，尤其是在血小板內部都能檢測到，血小板活化后即轉移至膜表面。
測血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)包括抗IgG、IgM、IgA有助于診斷免疫性血小板減少癥。
一些血小板的胞漿中含有核酸物質(zhì)RNA，可被噻唑橙(Thiazole orange,TO)染色稱(chēng)網(wǎng)織血小板。網(wǎng)織血小板是剛從骨髓中釋放出來(lái)的血小板，可用于血小板減少性疾病的鑒別診斷和療效監測。
3.輔助白血病和淋巴瘤分型和診斷
FCM是血液病MICC分型法中免疫表型分析的重要手段。免疫分型可為臨床指導治療，判斷預后，預測復發(fā)提供幫助。
(1)白血病系列分化抗原：
T淋巴細胞白血�。篊D3、CD5、CD7、CD10
B淋巴細胞白血�。篊Dl9、CD20、CD21、CD22，CDl0
NK細胞白血�。篊Dl6、CD56、CD57
粒細胞白血�。篊Dl3、CD33、MPO(髓過(guò)氧化酶)
單核細胞白血�。篊Dl4、CDl5、 CDl1b
紅血�。貉吞堑鞍譇(glycophorinA)，CDl3
巨核細胞白血�。篊D41，CD42、CD61
(2)白血病系列非特異性抗原：
CD34+、HLA-DR+、CD38-為干細胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+為原始細胞，CD34-、HLA-DR-、CD38+為幼稚細胞。
白血病細胞系列確定后，可根據系列抗原表達特點(diǎn)選擇單抗進(jìn)一步分亞型。
4.HIV和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)
HIV主要感染CD4+T細胞，CD4+受體是病毒進(jìn)入的主要途徑。正常血中CD4+T細胞約1000細胞/ul(400---1500細胞/ul)。<400—500細胞/ul表示病毒強烈影響免疫系統。<200細胞/ul即使沒(méi)有癥狀可確定AIDS，有預后價(jià)值。HIV感染早期CD8+T細胞增多，發(fā)展為AIDS則下降。
5.DNA含量分析以及細胞分化周期分析
DNA含量檢測根據細胞周期動(dòng)力學(xué)概念，在一個(gè)周期內可分為4個(gè)時(shí)相，依次為G1期、S期、G2期和M期，見(jiàn)圖2。利用DNA分析軟件可以確定各時(shí)相細胞的比例。能夠進(jìn)行DNA含量分析的標本可以是PBL，正常、病變或腫瘤組織，針吸或活檢組織，石蠟包埋組織，胸水、腹水，膀胱沖洗液和體外培養細胞。
DNA含量分析的目的在于確定某一組織或細胞群體的增殖狀態(tài)，引入DNA指數(D1)即DNA倍體的概念可以用于區別腫瘤的良惡性，惡性腫瘤的增殖狀態(tài)。
二倍體細胞的DI=1，在臨床上二倍體細胞DI在0.9—1.0之間，根據DI可以確定細胞DNA倍體。
6.化療藥物用藥指導，敏感藥物篩選
藥物作用處理后的細胞采用Calcein-AM(Florescein-methylene aminodiacetic acid 熒光素亞甲亞氨二醋酸)與PI染色。Calcein-AM 為非熒光乙酰甲氨基酯經(jīng)活細胞非特異性酯酶水解可變?yōu)闊晒饨Y合物，而死細胞不能水解因而無(wú)熒光。死細胞可被PI染成紅色，活細胞不被PI染色，兩者區分明顯，可用以篩選藥物。
7.實(shí)體器官移植配型和排異監測
可判斷受者的免疫狀態(tài)、免疫抑制劑療效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型檢測類(lèi)抗原的抗體(PRA)、血管內皮細胞抗原(VEA)抗體，可以提高移植成功率。
8.細胞凋亡(cell apoptosis)檢測
細胞凋亡可清除體內有害的細胞群，維持內環(huán)境的穩定。細胞凋亡闡明一些疾病的發(fā)病機制，導致疾病新療法的出現。FCM利用光散射和熒光染色能夠通過(guò)檢測細胞光散射改變、膜結構和轉運功能改變、DNA含量變化和DNA斷裂點(diǎn)標記，從多方面分析和鑒定凋亡。是目前能夠同時(shí)區分凋亡與壞死的唯一手段。
碘化丙啶(P1)標記FCM分析時(shí)，在細胞周期分析圖中表現為G0/G1期峰前的亞G1期(sub-G1)峰。
位于細胞膜脂質(zhì)雙層內側的磷脂酰絲氨酸(Ps)，反轉至外側是凋亡早期膜結構的特異性改變。annexin-V是一種Ca2+依賴(lài)的磷脂結合蛋白，與PS具有高親和力，以酶或熒光素標記的annexin-V為探針可鑒定凋亡，與PI結合經(jīng)流式細胞儀(FCM)分析，是唯一可區分凋亡早、晚期(如何區分)與壞死的方法。見(jiàn)圖3。
9.Th1與Th2細胞及細胞因子
輔助性T細胞根據其產(chǎn)生的細胞因子及功能的不同可分為T(mén)h1與Th2兩大類(lèi)。Th1細胞分泌IL-2、IFNγ、主要參與細胞免疫;Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要參與體液免疫。兩者相互調節、相互平衡，其平衡失調與多種疾病有關(guān)。應用流式細胞儀可檢測細胞內細胞因子。
近年來(lái)美國B(niǎo)D公司提供CBA(Cytometric bead array),采用一系列微珠組合來(lái)捕獲并結合流式細胞儀技術(shù)檢測溶液中被檢測物質(zhì)的量。此法優(yōu)點(diǎn)為同時(shí)可檢測多項指標如人Th1/Th2 CBA可檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ;人炎癥性細胞因子CBA可同時(shí)檢測IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、和IL-12。
10.網(wǎng)織紅細胞計數
傳統技術(shù)用煌焦油藍染料,染色涂片后,光鏡下計數,方法費時(shí)且只計數1000個(gè)細胞,誤差較大。使用噻唑橙(Thiazole Orange, TO)染料,可與核酸形成熒光-核酸復合物,流式細胞儀上檢測50000個(gè)紅細胞求得百分率與絕對數,有助于貧血的鑒別
11.造血干祖細胞檢測
骨髓移植的適應癥主要有白血病、先天性免疫缺陷病、再障等。骨髓移植實(shí)質(zhì)是造血干細胞的移植。CD34+細胞常作為多能干細胞的標志。
骨髓移植前檢測CD34+細胞是很重要的一個(gè)步驟。樣品經(jīng)抗CD34+熒光抗體染色，可識別和定量CD34+細胞。
12.糖皮質(zhì)激素受體(glycocorticoid receptor,GCR)檢測
測GCR常用細胞溶質(zhì)放射配基受體(請確認)結合測定，它可定量，但需細胞量多、檢測時(shí)間長(cháng)。流式細胞儀可測淋巴細胞總GCR，此法雖半定量，但檢測所需樣品量少。對長(cháng)期激素治療或確定下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能紊亂，評估細胞內GCR水平有一定價(jià)值。
13.環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX)檢測
環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素(PG)的限速酶。它催化產(chǎn)生的PG參與機體多種生理和病理生理過(guò)程。COX有兩種類(lèi)型:COX-1和COX-2。COX-1為結構性的“看家基因”產(chǎn)物,在多數組織細胞中持續低濃度表達，參與維持機體正常的生理功能。COX-2為可誘導性的，炎癥、細胞因子、生長(cháng)因子等刺激可使其大量表達，參與和加重炎癥反應，促進(jìn)腫瘤細胞增殖、新生血管形成，促進(jìn)黏附、抑制免疫與抑制細胞凋亡。應用流式細胞儀可監測人血單核細胞經(jīng)LPS刺激后COX-2與COX-1的水平。對炎癥、血栓、腫瘤等病的發(fā)病機制、療效和預后判斷均有一定價(jià)值。
近年來(lái)應用流式細胞術(shù)檢測特異性CTL細胞、細胞信號傳導等亦在迅速開(kāi)展。
一、流式細胞儀(flowcytometer FCM)
1.流式細胞儀的基本結構
流式細胞儀的結構一般可分四部分。
(1)流動(dòng)系統
流動(dòng)系統是流式細胞儀的心臟，因為細胞懸液在被檢測之前必須首先形成一個(gè)很細的穩流，細胞在其內部排成單列通過(guò)測量區。細胞懸液和鞘液分別(是分別還是同時(shí))進(jìn)入流動(dòng)室，鞘液的作用是使樣品懸液中的粒子組成單一縱列方式通過(guò)測量區，保證每個(gè)細胞通過(guò)激光照射區的時(shí)間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。
(2)激光系統
多采用氬離子激光器。使發(fā)射光在可見(jiàn)光譜范圍內488nm激發(fā)。目前市場(chǎng)上大多數熒光色素適用于此波長(cháng)。激光的單色性好，功率高，穩定。
(3)光學(xué)和電子系統
激光束射至經(jīng)流體力學(xué)聚焦的個(gè)別細胞和粒子后，光散射在各個(gè)方向(360?)發(fā)射。有兩個(gè)光散射參數需收集，前向角散射(FSC)主要用于檢測細胞體積的大小。
另一為側向散射(SSC)用于檢測細胞膜，胞質(zhì)，核膜等細胞內部結構及胞質(zhì)內顆粒。
熒光信號是由對細胞進(jìn)行染色的特異性熒光染料受到激光激發(fā)后發(fā)射的。熒光波長(cháng)與激光波長(cháng)不同，而且強度較弱，因此要使用光學(xué)濾片濾除非熒光信號并使用靈敏的檢測器。熒光測量時(shí)通常使用線(xiàn)性放大器(即放大器的輸出與輸入是線(xiàn)性關(guān)系)，適用于較小范圍內變化的信號，如前向角散射和DNA測量。但有時(shí)需要對數放大器(即輸出與輸入是對數關(guān)系)。如果原來(lái)輸出為1，當輸入增加到原來(lái)的10倍時(shí)，輸出是2。在免疫學(xué)檢測中常使用對數放大器，因為在免疫學(xué)的樣品中，可能有的細胞未被染色而僅有自發(fā)熒光，為陰性群體;被染上色的細胞特異性熒光可能比自發(fā)熒光強數倍到數十倍，為陽(yáng)性群體。使用對數放大器可以同時(shí)分辨出亮度差異大的多個(gè)細胞亞群，容易選定不同亞群間的分界點(diǎn)，有利于流式細胞儀的分析和分選。
熒光信號的補償：當用一種激光束同時(shí)激發(fā)兩種染料發(fā)射出兩種不同波長(cháng)的熒光時(shí)，兩種熒光發(fā)射光譜有一定的重迭，可用電補償減去不適合熒光通道測定的重迭信號。
(4)數據貯存和計算機控制系統
數據貯存采用列表排隊(List Mode)方式。利用計算機用多種圖形來(lái)表明各參數間的相互關(guān)系，以單參數直方圖，雙參數二維點(diǎn)圖，等高圖等方式顯示。數據分析一般設定正確的分析范圍，劃分計算區域和計算結果。
(5)細胞分選系統
細胞分選可使被指定的細胞從細胞群體中分離出來(lái)。流式細胞儀所測定的任何參數都可以作為細胞分選依據，被選出來(lái)的細胞的均一性與所測參數有關(guān)。其工作原理是把液滴形成信號在壓電晶體上使之產(chǎn)生機械振動(dòng)(不太通順)，液柱斷裂成一連串均勻的液滴，一部分液滴中包有細胞，如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細胞特性相符，則帶有特定的電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，偏轉落入指定的收集器內，完成細胞分類(lèi)收集的目的。
2.流式細胞儀的類(lèi)型
流式細胞儀分為兩大類(lèi)，一類(lèi)為臨床分析型(又名臺式機)，特點(diǎn)為儀器光路調節系統固定，自動(dòng)化程度高，易學(xué)易掌握。如Becton Dickinson(簡(jiǎn)稱(chēng)BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等;另一類(lèi)為科研(分選)型，特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細胞分選出來(lái)，并且將單個(gè)或指定個(gè)數的細胞分選到特定的培養孔或板上，同時(shí)可選配多種波長(cháng)類(lèi)型的激光器，適用于更廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。最近BD公司推出了FACSAria,其優(yōu)點(diǎn)為具備科研分選型標準而操作與臨床分析型同樣簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高。
3.流式細胞儀檢測的質(zhì)量控制
(1)樣品與試劑
血液、骨髓、體液等必須當天采集，6 h之內進(jìn)行免疫熒光染色;活化血小板檢測應在采血后立即染色與固定。組織樣品可采用機械法去聚集并過(guò)濾，最好用單細胞制備儀(medimachine)處理。試劑、緩沖液、溶血劑、固定劑等必須符合標準。
(2)對照設置
目的是避免各種因素可能造成的假陽(yáng)性或假陰性反應。
�、偻蛯φ眨号c單克隆抗體(MoAb)相同的、未免疫小鼠標記熒光素的免疫球蛋白亞類(lèi)作對照。主要考慮細胞的自發(fā)熒光、非特異性抗體結合等影響因素。
�、陉�(yáng)性對照：已知陽(yáng)性標本能否確定為陽(yáng)性。達不到要求時(shí)不能進(jìn)行臨床試驗。
�、坳幮詫φ眨河靡阎槐磉_某種抗原的細胞作樣品檢測，應出現陰性。目的是避免實(shí)驗的非特異性反應。
�、苷φ眨簩σ环N新的MoAb，在使用前進(jìn)行對照試驗，可保證儀器在最佳條件下獲取樣品。
�、葙|(zhì)控品：
試劑廠(chǎng)方提供與待測樣品成分相近的穩定的質(zhì)控物，并提供檢測項目的靶值和質(zhì)控范圍，作為某一試驗項目的全程質(zhì)量檢測物，評估試驗結果的可靠性。如BDMulti-Check Control 是淋巴細胞及其亞群分析的全血質(zhì)控品。
(3)儀器的校準與性能檢測
使用標準熒光微球，運行FACSComp軟件，校準通過(guò)，表明儀器狀況良好。
二、流式細胞儀的功能和臨床應用
流式細胞儀最大的貢獻在于促進(jìn)了免疫學(xué)基礎研究和臨床診斷。目前流式細胞術(shù)已被廣泛用于細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)和臨床檢驗等多學(xué)科領(lǐng)域的基礎和臨床研究。
1.流式細胞儀的功能
(1)細胞參量分析
包括細胞大小、形狀、蛋白熒光、氧化還原狀態(tài)，膜的結構、流動(dòng)性、微粘度、膜電位，酶活性，鈣離子含量，pH值，染色質(zhì)結構，DNA合成，堿基比例等。
(2)細胞表型分析
從1982年正式以CD(clustor of differentiation) 來(lái)表達(示)白細胞分化抗原。己確定的CD序號從CDl一CD247，這些細胞表面分化抗原，可以將人體組織細胞分為T(mén)細胞、B細胞、髓樣細胞、血小板、NK細胞、粘附分子、內皮細胞，細胞因子受體/趨化性細胞因子受體、干細胞/祖細胞、碳水化合物/凝集素、 非譜系組共13系。CD抗原在細胞表面的獲得和丟失在一定程度上反映細胞分化程度和功能狀態(tài)。研究CD的意義在于①理解CD抗原分子本身的一些特性及其與免疫功能的關(guān)系;②認識和探討CD抗原所表達細胞的功能及其在疾病發(fā)生中的作用。
(3)細胞分選
這是FCM的一項重要功能，目前FCM對細胞亞群的分選純度可以達到99%，除了對特定的亞群加以分選外，還可以分出所需要的染色體加以分析甚至能結合PCR方法加以擴增，這多用于研究中。
2.流式細胞儀檢測在臨床的應用
流式細胞儀的功能決定了其在醫學(xué)領(lǐng)域的重要地位，目前在臨床上主要用于細胞表型分析、造血系腫瘤診斷和分型、移植前配型及與免疫有關(guān)疾病分析等。
(1)CD抗原與白細胞分析
�、賂細胞
CD3+(注意下面CD分子的格式應一致)：成熟T淋巴細胞，是鑒定T細胞的重要標志，判斷細胞免疫狀況。
CD4+： T輔助/誘導細胞亞群
CD8+： T抑制/細胞毒亞群
CD4+ /CD8+比值：是免疫狀態(tài)標志的檢測指標，正常CD4+ /CD8+比值為1.2∽2.9,在腫瘤、免疫缺陷病、病毒感染、自身免疫病、器官移植后都有診斷、預后和治療的指導價(jià)值，其比例降低與病變程度有關(guān)。
CD8+ /CD28+ 與CD8+ /CD28—：前者為細胞毒T細胞(Tc)，后者為抑制性T細胞(Ts)。
CD4+/CD25+ 與CD4+ /CD25—：前者為免疫調節性T細胞，后者為效應T細胞。
CD4+ /CD29+：輔助性誘導細胞，輔助B細胞產(chǎn)生抗體和誘導細胞介導的淋巴細胞溶解作用，自身免疫性疾病可見(jiàn)增多。
CD4+ /CD 45RA+ 與CD4+ /CD 45Ro+：前者為原初細胞(naive cell)主要功能是誘導Ts細胞活化和輔助其功能活性。SLE、MS患者外周血CD4+ /CD 45RA+細胞減少，后者為記憶細胞(memory cell)。
�、贐淋巴細胞：CD19+是總的B淋巴細胞特異抗原，判斷體液免疫狀況。CD23+為IgE低親和力受體，分布于B淋巴細胞、嗜酸粒細胞上，增多與變態(tài)反應性疾病、腎病綜合癥、白血病等有關(guān)。
�、跱K淋巴細胞： CD3—/CD(16+56)+ 細胞表型。
�、軉魏�/巨噬細胞標志：CD14+細胞
(2)CD 抗原與血小板分析
分析單個(gè)血小板或血小板亞群膜糖蛋白，是血小板膜糖蛋白檢測分析方法學(xué)上的重大發(fā)展，對先天性與獲得性血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，尤其是評價(jià)血栓性疾病與血栓前狀態(tài)發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中血小板的活化程度及其診斷、治療、預防等具有特別重要的意義。FCM分析血小板膜糖蛋白方法簡(jiǎn)便、快速、標本用量少、靈敏度高、特異性強、結果準確，為血小板的基礎和臨床研究提供了嶄新的手段。
CD62p(P選擇素)是一種糖蛋白，存在于血小板α顆粒以及內皮細胞中。CD62p在體內或體外刺激后，即轉移至膜表面，巨核細胞也有表達。CD62p又稱(chēng)GMP—140或PADGEM蛋白(血小板活化依賴(lài)α顆粒膜蛋白)，它在血小板與單核細胞及中性粒細胞相互作用中起關(guān)鍵作用。
CD63為溶酶體膜糖蛋白，在多種細胞的表面和胞漿內，尤其是在血小板內部都能檢測到，血小板活化后即轉移至膜表面。
測血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)包括抗IgG、IgM、IgA有助于診斷免疫性血小板減少癥。
一些血小板的胞漿中含有核酸物質(zhì)RNA，可被噻唑橙(Thiazole orange,TO)染色稱(chēng)網(wǎng)織血小板。網(wǎng)織血小板是剛從骨髓中釋放出來(lái)的血小板，可用于血小板減少性疾病的鑒別診斷和療效監測。
3.輔助白血病和淋巴瘤分型和診斷
FCM是血液病MICC分型法中免疫表型分析的重要手段。免疫分型可為臨床指導治療，判斷預后，預測復發(fā)提供幫助。
(1)白血病系列分化抗原：
T淋巴細胞白血�。篊D3、CD5、CD7、CD10
B淋巴細胞白血�。篊Dl9、CD20、CD21、CD22，CDl0
NK細胞白血�。篊Dl6、CD56、CD57
粒細胞白血�。篊Dl3、CD33、MPO(髓過(guò)氧化酶)
單核細胞白血�。篊Dl4、CDl5、 CDl1b
紅血�。貉吞堑鞍譇(glycophorinA)，CDl3
巨核細胞白血�。篊D41，CD42、CD61
(2)白血病系列非特異性抗原：
CD34+、HLA-DR+、CD38-為干細胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+為原始細胞，CD34-、HLA-DR-、CD38+為幼稚細胞。
白血病細胞系列確定后，可根據系列抗原表達特點(diǎn)選擇單抗進(jìn)一步分亞型。
4.HIV和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)
HIV主要感染CD4+T細胞，CD4+受體是病毒進(jìn)入的主要途徑。正常血中CD4+T細胞約1000細胞/ul(400---1500細胞/ul)。<400—500細胞/ul表示病毒強烈影響免疫系統。<200細胞/ul即使沒(méi)有癥狀可確定AIDS，有預后價(jià)值。HIV感染早期CD8+T細胞增多，發(fā)展為AIDS則下降。
5.DNA含量分析以及細胞分化周期分析
DNA含量檢測根據細胞周期動(dòng)力學(xué)概念，在一個(gè)周期內可分為4個(gè)時(shí)相，依次為G1期、S期、G2期和M期，見(jiàn)圖2。利用DNA分析軟件可以確定各時(shí)相細胞的比例。能夠進(jìn)行DNA含量分析的標本可以是PBL，正常、病變或腫瘤組織，針吸或活檢組織，石蠟包埋組織，胸水、腹水，膀胱沖洗液和體外培養細胞。
DNA含量分析的目的在于確定某一組織或細胞群體的增殖狀態(tài)，引入DNA指數(D1)即DNA倍體的概念可以用于區別腫瘤的良惡性，惡性腫瘤的增殖狀態(tài)。
二倍體細胞的DI=1，在臨床上二倍體細胞DI在0.9—1.0之間，根據DI可以確定細胞DNA倍體。
6.化療藥物用藥指導，敏感藥物篩選
藥物作用處理后的細胞采用Calcein-AM(Florescein-methylene aminodiacetic acid 熒光素亞甲亞氨二醋酸)與PI染色。Calcein-AM 為非熒光乙酰甲氨基酯經(jīng)活細胞非特異性酯酶水解可變?yōu)闊晒饨Y合物，而死細胞不能水解因而無(wú)熒光。死細胞可被PI染成紅色，活細胞不被PI染色，兩者區分明顯，可用以篩選藥物。
7.實(shí)體器官移植配型和排異監測
可判斷受者的免疫狀態(tài)、免疫抑制劑療效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型檢測類(lèi)抗原的抗體(PRA)、血管內皮細胞抗原(VEA)抗體，可以提高移植成功率。
8.細胞凋亡(cell apoptosis)檢測
細胞凋亡可清除體內有害的細胞群，維持內環(huán)境的穩定。細胞凋亡闡明一些疾病的發(fā)病機制，導致疾病新療法的出現。FCM利用光散射和熒光染色能夠通過(guò)檢測細胞光散射改變、膜結構和轉運功能改變、DNA含量變化和DNA斷裂點(diǎn)標記，從多方面分析和鑒定凋亡。是目前能夠同時(shí)區分凋亡與壞死的唯一手段。
碘化丙啶(P1)標記FCM分析時(shí)，在細胞周期分析圖中表現為G0/G1期峰前的亞G1期(sub-G1)峰。
位于細胞膜脂質(zhì)雙層內側的磷脂酰絲氨酸(Ps)，反轉至外側是凋亡早期膜結構的特異性改變。annexin-V是一種Ca2+依賴(lài)的磷脂結合蛋白，與PS具有高親和力，以酶或熒光素標記的annexin-V為探針可鑒定凋亡，與PI結合經(jīng)流式細胞儀(FCM)分析，是唯一可區分凋亡早、晚期(如何區分)與壞死的方法。見(jiàn)圖3。
9.Th1與Th2細胞及細胞因子
輔助性T細胞根據其產(chǎn)生的細胞因子及功能的不同可分為T(mén)h1與Th2兩大類(lèi)。Th1細胞分泌IL-2、IFNγ、主要參與細胞免疫;Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要參與體液免疫。兩者相互調節、相互平衡，其平衡失調與多種疾病有關(guān)。應用流式細胞儀可檢測細胞內細胞因子。
近年來(lái)美國B(niǎo)D公司提供CBA(Cytometric bead array),采用一系列微珠組合來(lái)捕獲并結合流式細胞儀技術(shù)檢測溶液中被檢測物質(zhì)的量。此法優(yōu)點(diǎn)為同時(shí)可檢測多項指標如人Th1/Th2 CBA可檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ;人炎癥性細胞因子CBA可同時(shí)檢測IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、和IL-12。
10.網(wǎng)織紅細胞計數
傳統技術(shù)用煌焦油藍染料,染色涂片后,光鏡下計數,方法費時(shí)且只計數1000個(gè)細胞,誤差較大。使用噻唑橙(Thiazole Orange, TO)染料,可與核酸形成熒光-核酸復合物,流式細胞儀上檢測50000個(gè)紅細胞求得百分率與絕對數,有助于貧血的鑒別
11.造血干祖細胞檢測
骨髓移植的適應癥主要有白血病、先天性免疫缺陷病、再障等。骨髓移植實(shí)質(zhì)是造血干細胞的移植。CD34+細胞常作為多能干細胞的標志。
骨髓移植前檢測CD34+細胞是很重要的一個(gè)步驟。樣品經(jīng)抗CD34+熒光抗體染色，可識別和定量CD34+細胞。
12.糖皮質(zhì)激素受體(glycocorticoid receptor,GCR)檢測
測GCR常用細胞溶質(zhì)放射配基受體(請確認)結合測定，它可定量，但需細胞量多、檢測時(shí)間長(cháng)。流式細胞儀可測淋巴細胞總GCR，此法雖半定量，但檢測所需樣品量少。對長(cháng)期激素治療或確定下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能紊亂，評估細胞內GCR水平有一定價(jià)值。
13.環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX)檢測
環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素(PG)的限速酶。它催化產(chǎn)生的PG參與機體多種生理和病理生理過(guò)程。COX有兩種類(lèi)型:COX-1和COX-2。COX-1為結構性的“看家基因”產(chǎn)物,在多數組織細胞中持續低濃度表達，參與維持機體正常的生理功能。COX-2為可誘導性的，炎癥、細胞因子、生長(cháng)因子等刺激可使其大量表達，參與和加重炎癥反應，促進(jìn)腫瘤細胞增殖、新生血管形成，促進(jìn)黏附、抑制免疫與抑制細胞凋亡。應用流式細胞儀可監測人血單核細胞經(jīng)LPS刺激后COX-2與COX-1的水平。對炎癥、血栓、腫瘤等病的發(fā)病機制、療效和預后判斷均有一定價(jià)值。
近年來(lái)應用流式細胞術(shù)檢測特異性CTL細胞、細胞信號傳導等亦在迅速開(kāi)展。
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