流式細胞儀的工作原理和應用

　　流式細胞儀是進(jìn)行流式細胞分析的儀器，集電子、計算機、激光、流體理論于一體，被譽(yù)為試驗室的“CT”。

　　流式細胞術(shù)(Flow CytoMeter，FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，它可高速分析上萬(wàn)個(gè)細胞，并能同時(shí)從一個(gè)細胞中測得多個(gè)參數，與傳統熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當代最先進(jìn)的細胞定量分析技術(shù)。

　　一.工作原理

　　將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動(dòng)室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管?chē)姵�，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著(zhù)樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)檢測區域。

　　流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小;熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(cháng)的熒光信號。

　　這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過(guò)A/D轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進(jìn)行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來(lái)，還可以數據文件的形式存儲在硬盤(pán)上以備日后的查詢(xún)或進(jìn)一步分析。

　　檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數目。一般來(lái)說(shuō)，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數，這視其模數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個(gè)參數的直方圖，也可以選擇二維的三點(diǎn)圖、等高線(xiàn)圖、灰度圖或三維立體視圖。

　　細胞的分選是通過(guò)分離含有單細胞的液滴而實(shí)現的。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現細胞的分離。

　　二.應用范圍

　　用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學(xué)研究，并已開(kāi)始用于細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和愛(ài)滋病感染者T4、T8細胞的記數。

　　70年代以來(lái)，隨著(zhù)流式細胞技術(shù)水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。流式細胞術(shù)已普遍應用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫學(xué)和基礎醫學(xué)研究領(lǐng)域

　　三.技術(shù)特點(diǎn)

　　流式細胞儀作為一種先進(jìn)的細胞定量分析檢測儀器，設計上采用了許多獨特的技術(shù)，其中涉及到液流系統、光路系統、信號測量和細胞分選等4個(gè)方面。

　　四.展望

　　流式細胞儀從細胞技術(shù)開(kāi)始發(fā)展到今天，60至70年代是其飛速發(fā)展時(shí)期，激光技術(shù)、噴射技術(shù)以及計算機的應用使流式細胞儀在原理和結構上形成了固定的模式。

　　80年代則是流式細胞儀的商品化時(shí)期，這期間不斷有新型號的儀器推出，在多參數檢測技術(shù)上不斷提高。

　　進(jìn)入90年代，隨著(zhù)微電子技術(shù)特別是計算機技術(shù)的發(fā)展，流式細胞儀的功能也越來(lái)越強大。在數據管理、數據分析方面有了長(cháng)足進(jìn)步。但是，在技術(shù)原理和設計方面并沒(méi)有突破性的進(jìn)展。人們的注意力開(kāi)始轉向流式細胞儀的應用，新的熒光探針、新的熒光染料、新的染色方法不斷推出，使流式細胞技術(shù)在新的細胞參數分析方面日益發(fā)展。

　　從新推出的儀器看，流式細胞儀會(huì )在硬件上不斷更新，采用更新的器件(如半導體激光、大規模集成電路)，以實(shí)現小型化;用數字電路取代模擬電路，充分發(fā)揮微處理器的功能以實(shí)現簡(jiǎn)單化;在軟件上提高數據自動(dòng)分析能力，充分發(fā)揮圖形界面的優(yōu)點(diǎn)，使操作更加簡(jiǎn)便。