厭氧菌的分離、培養及鑒定

　　一 摘要：

　　1.1 實(shí)驗內容：

　　厭氧菌的分離、培養及鑒定;

　　1.2 目的：

　　1 掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。

　　了解厭氧菌菌鑒定的一般方法。

　　2 復習并鞏固平時(shí)所學(xué)的微生物知識與技能。

　　3 培養獨立思考、設計和動(dòng)手實(shí)驗的能力。

　　二 介紹：

　　厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類(lèi)繁多，其生理作用日益受到人們的重視。

　　專(zhuān)性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養及活菌計數的關(guān)鍵是提供無(wú)氧和低氧化還原電勢的培養環(huán)境。

　　厭氧菌的培養：

　　在培養厭氧菌時(shí)，最需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0,O2的濃度與1atm的氧平衡時(shí)，O2——O2-反應的電位是0.81V，因此，在-0.33V時(shí)，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽和了空氣的水中含有1.48×10-55個(gè)O2。所以說(shuō)，要保證厭氧菌培養時(shí)的低電位是很重要的。

　　厭氧菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實(shí)驗介紹的是一種簡(jiǎn)便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術(shù)，亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術(shù) 因此他是世界上第一個(gè)分離純化厭氧菌的人。

　　以后這項技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一套完整技術(shù)，而且多年來(lái)的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專(zhuān)性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：預還原培養基制好后，可隨時(shí)取用進(jìn)行試驗;任何時(shí)間觀(guān)察或檢查試管內的菌種都不會(huì )干擾厭氧條件。

　　三 實(shí)驗材料與設備：

　　3.1 分離與培養：

　　3.1.1菌種：待測樣品;

　　3.1.2 培養基：改良的PRAS培養基(氮素自加)

　　[配方組成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值為7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹(shù)脂刃天青(還原指示劑)1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養基加入1%Na2S(還原劑)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制劑)各0.1ml]

　　3.1.3 試劑：冰塊 Na2S NaHCO3

　　3.1.4 器材：高純氮氣 厭氧管 厭氧手套箱 注射器 恒溫培養箱 銅柱除氧系統 定量加樣器 厭氧罐 超聲波破碎儀 酒精燈 冰塊 水浴鍋 記號筆 振蕩器 等

　　3.2 菌種的鑒定：

　　3.2.1 菌種：待測菌

　　3.2.2 培養基;糖發(fā)酵培養基、蛋白胨水培養基、淀粉培養基(液體);

　　3.2.3 試劑;乙醚 吲哚試劑 盧戈氏碘液;

　　3.2.4 器材：超凈工作臺 恒溫培養箱 高壓蒸汽滅菌鍋 接種環(huán) 移液管載玻片 顯微鏡 等

　　四、實(shí)驗方法與步驟：

　　4.1分離與培養

　　4.1.1 銅柱系統除氧

　　銅柱是一個(gè)內部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來(lái)控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來(lái)的氣體如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故當這些氣體通過(guò)溫度約360℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏�。當向氧化狀的銅柱通入H2時(shí)，H2與CuO中的氧就結合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復的使用，并不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。

　　4.1.2 預還原培養基及稀釋液的制備

　　在無(wú)氧無(wú)菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，制作預還原培養基及稀釋液時(shí)，先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長(cháng)針頭以排除O2。此時(shí)可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無(wú)色，說(shuō)明試管內已成為無(wú)氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，于滅氧罐中滅菌備用。

　　4.1.3 分離

　　(1)編號

　　取五支無(wú)菌水試管，分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。

　　(2)稀釋

　　在無(wú)氧無(wú)菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無(wú)菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無(wú)菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)��?0-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管計數。

　　(3)滾管分離

　　1)滾管

　　將無(wú)氧無(wú)菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時(shí)，要用N2在培養基內中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內空氣，然后把培養基加入管內，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內，及時(shí)拔出充氣針頭。用無(wú)菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤(pán)中迅速滾動(dòng)，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會(huì )即刻形成凝固層。

　　2)分離純化

　　生成的菌落需挑取出來(lái)，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀(guān)察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開(kāi)試管膠塞，同時(shí)迅速將氣流適當、火焰滅過(guò)菌的氮氣長(cháng)針頭插入管內。同時(shí)，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過(guò)菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養，培養24h或更長(cháng)時(shí)間或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。

　　3)劃線(xiàn)分離

　　將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著(zhù)打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線(xiàn)后的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因為CO2比空氣重，開(kāi)啟后管塞不致有空氣殘留。劃線(xiàn)后的滾管，置34-37度下培養，便可長(cháng)出菌落。

　　4.1.4 鏡檢與計數

　　(1)鏡檢

　　挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀(guān)察菌體形態(tài)。

　　(2)計數

　　液體純培養物經(jīng)系列稀釋后，按上述滾管法培養。然后對固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有厭氧菌數量cfu/g(mL)樣品=A×10ml×X/10×D

　　A-0.1mL滾管計數的實(shí)際平均值;

　　X- 鏡檢呈現為厭氧菌的數目;

　　X/10-菌落中厭氧菌的概率;

　　D- 稀釋倍數

　　4.2 菌種的鑒定

　　4.2.1糖發(fā)酵試驗

　　糖發(fā)酵實(shí)驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類(lèi)作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產(chǎn)酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來(lái)斷定。在配制培養基時(shí)預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)]，當發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。

　　具體實(shí)驗步驟：

　�、� 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)�之后在無(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

　�、� 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

　�、� 24h后觀(guān)察各管中液體顏色變化及產(chǎn)氣情況。

　　4.2.2 蛋白質(zhì)分解實(shí)驗

　�、� 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)�之后在無(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

　�、� 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

　�、�24h后各管分別進(jìn)行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。

　　4.2.3 淀粉水解實(shí)驗

　�、� 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)�之后在無(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

　�、� 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

　�、� 24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀(guān)察淀粉的水解情況。

　　五 注意事項及注釋?zhuān)?

　　1 注射器在使用前必須經(jīng)過(guò)121℃、20min滅菌。

　　2 注意無(wú)菌操作，保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。

　　3 用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后，如需再次吸取，應快速將注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。

　　4樹(shù)脂刃天青(resazurin)既是還原劑又是指示劑，它可以把培養基中殘留的溶解氧去除，其氧化還原電位指示敏感范圍為-42mV。有氧時(shí)呈紫色或粉紅色，無(wú)氧時(shí)呈無(wú)色(培養基的顏色)，它是較為理想的氧化還原電位指示劑和培養嚴格厭氧菌不可缺少的。

　　5培養基中加入的青霉素是用來(lái)抑制其它細菌生長(cháng)的，因為厭氧菌的細胞壁成分為假肽聚糖，不受青霉素影響。

　　6注射器在使用前必須先用培養基上面的氣體沖洗、填充，然后插入培養基的下層，以保證當培養基移入試管時(shí)，就處于無(wú)氧氣體層的下面。