實(shí)驗室常用微生物菌種的分離和純化方法

　　從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養物的“純潔”，防止其他微生物的混入。

　　1、用固體培養基分離和純化

　　單個(gè)微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長(cháng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結構的子細胞生長(cháng)群體，稱(chēng)為菌落。當固體培養基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。不同微生物在特定培養基上生長(cháng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征，可以成為對該微生物進(jìn)行分類(lèi)、鑒定的重要依據。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類(lèi)能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板，即培養平板的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是指固體培養基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養基表面或里面。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養基，每個(gè)孤立的活微生物體生長(cháng)、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的最常用手段。

　　1.1 稀釋倒平板法

　　首先把微生物懸液作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1000、1:10000)，然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時(shí)間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。

　　1.2 涂布平板法

　　因為將微生物懸液先加到較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì )使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(cháng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養后挑取單個(gè)菌落。

　　1.3 平板劃線(xiàn)法

　　最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線(xiàn)法，即用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行連續劃線(xiàn)(圖2)，微生物細胞數量將隨著(zhù)劃線(xiàn)次數的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線(xiàn)適宜的話(huà)，微生物能一一分散，經(jīng)培養后，可在平板表面得到單菌落。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細胞繁殖而來(lái)的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點(diǎn)到線(xiàn)”稀釋而達到分離目的的。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、放射法、四格法等。

　　1.4 稀釋搖管法

　　用固體培養基分離嚴格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)�試管迅速搖動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開(kāi)。培養后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無(wú)菌無(wú)氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無(wú)菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀(guān)察和菌落的移植。

　　2、用液體培養基分離和純化

　　大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿(mǎn)意的，因為它們的大多數種類(lèi)在固體培養基上長(cháng)得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養基上生長(cháng)，例如一些細胞大的細菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來(lái)獲得純培養。

　　稀釋法是液體培養基分離純化常用的方法。接種物在液體培養基中進(jìn)行順序稀釋?zhuān)�以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數試管中沒(méi)有微生物生長(cháng)，那么有微生物生長(cháng)的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長(cháng)的比例提高了，得到純培養物的機率就會(huì )急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(一般應超過(guò)95%)表現為不生長(cháng)。

　　3、單細胞(孢子)分離

　　只能分離出混雜微生物群體中占數量?jì)?yōu)勢的種類(lèi)是稀釋法的一個(gè)重要缺點(diǎn)。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養以獲得純培養，稱(chēng)為單細胞(或單孢子)分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類(lèi)、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細菌則較難。

　　較大的微生物，可采用毛細管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對于個(gè)體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒(méi)有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細胞分離，例如將經(jīng)適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀(guān)察，選取只含一個(gè)細胞的液體來(lái)進(jìn)行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

　　4、選擇培養分離

　　沒(méi)有一種培養基或一種培養條件能夠滿(mǎn)足一切微生物生長(cháng)的需要，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。如果某種微生物的生長(cháng)需要是已知的，也可以設計特定環(huán)境使之適合這種微生物的生長(cháng)，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來(lái)，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數。這種通過(guò)選擇培養進(jìn)行微生物純培養分離的技術(shù)稱(chēng)為選擇培養分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，在大多數場(chǎng)合微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時(shí)，單采用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養、生理、生長(cháng)條件等，采用選擇培養分離的方法�；蛞种剖勾蠖鄶滴⑸�物不能生長(cháng)，或造成有利于該菌生長(cháng)的環(huán)境，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養后使該菌在群落中的數量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對它進(jìn)行純培養分離。

　　4.1 利用選擇平板進(jìn)行直接分離

　　根據待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養條件，有多種方法可以采用。例如要分離高溫菌，可在高溫條件下進(jìn)行培養;要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進(jìn)行分離;有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動(dòng)的微生物分開(kāi)�？蓪⑽⑸�物群落點(diǎn)種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復進(jìn)行，得到純培養物。

　　4.2 富集培養

　　富集培養法原理和方法非常簡(jiǎn)單，利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應于該條件的微生物旺盛生長(cháng)，從而使其在群落中的數量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線(xiàn)、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養等等許多方面。在相同的培養基和培養條件下，經(jīng)過(guò)多次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養基上長(cháng)出單菌落。如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長(cháng)。通過(guò)多次重復移種便可以得到純的寄生菌。

　　5、二元培養物

　　分離的目的通常是要得到純培養。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。含有二種以上微生物的培養物稱(chēng)為混合培養物，而如果培養物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關(guān)系的培養物稱(chēng)為二元培養物。例如二元培養物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養物是在實(shí)驗室控制條件下可能達到的最接近于純培養的培養方法。另外，獵食細小微生物的原生動(dòng)物也很容易用二元培養法在實(shí)驗室培養，培養物由原生動(dòng)物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和粘菌。

　　在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用于實(shí)驗室微生物的分離與純化。微生物在固體培養基上生長(cháng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線(xiàn)等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(cháng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀(guān)察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。