PCR常見(jiàn)問(wèn)題

　　PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間

　　一般為48h以?xún)�，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

　　假陰性，不出現擴增條帶

　　PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。

　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

　　酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

　　引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條 帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

　　反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應用多大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

　　物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出 現假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。

　　假陽(yáng)性

　　出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

　　引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增 時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng) 性。需重新設計引物。

　　靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用。③必要時(shí)，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴 增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

　　出現非特異性擴增帶

　　PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：①必要時(shí)重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

　　出現片狀拖帶或涂抹帶

　　PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數。

　　克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么?

　　最佳插入片段：載體比需實(shí)驗確定。1：1(插入片段：載體)常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4oC過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì )自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時(shí)能滿(mǎn)足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4oC過(guò)夜。

　　PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化?

　　如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會(huì )產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

　　如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗?

　　A)涂布未轉化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。

　　B)轉化完整質(zhì)粒，計算菌落生長(cháng)數，測定轉化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉化率為： 產(chǎn)生菌落的總數/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：1000克隆X10(3次方) ng /鋪板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug轉化pGEM-T應用10(8次方)cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。

　　C)如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍斑(用指定步驟10(8次方)cfu/ ug感受態(tài)細胞)，表明載體失去T�？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801，M1804，M1794)質(zhì)量標準好無(wú)核酸酶污染，不應用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。

　　D)用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的實(shí)驗步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。

　　對照實(shí)驗結果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗出了什么問(wèn)題?

　　A)連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿(mǎn)足大多數克隆，為提高效率，需4oC過(guò)夜。

　　B)插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

　　C)插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì )產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

　　D)帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料(TM042)。

　　E)高度重復序列可能會(huì )不穩定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株。