什么是熒光顯微鏡

　　什么是熒光顯微鏡?

　　熒光顯微鏡是以紫外線(xiàn)為光源， 用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀(guān)察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質(zhì)的吸收、運輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。

　　細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線(xiàn)照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線(xiàn)照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

　　熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區別：

　　1.照明方式通常為落射式，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上;

　　2.光源為紫外光，波長(cháng)較短，分辨力高于普通顯微鏡;

　　3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見(jiàn)光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線(xiàn)，用以保護人目。

　　熒光顯微鏡的應用與注意

　　使用：

　　一、將材料片放在顯微鏡的載物臺上。

　　二、打開(kāi)熒光顯微鏡穩壓器，然后啟動(dòng)紫外燈，紫外燈15min內不得關(guān)閉，關(guān)閉后3min內不得再啟動(dòng)。

　　三、將激發(fā)濾光片轉至v，分色片調到v，選用495或475nm阻擋濾光片。

　　四、選用uvFL40、uvFL100熒光接物鏡鏡檢。

　　五、在玻片上加無(wú)熒光油，先用40 x，再用100 x調焦鏡檢.呈現熒光。

　　六、因熒光物質(zhì)受紫外光照射時(shí)隨時(shí)間的增長(cháng)熒光逐漸變弱，因此鏡檢時(shí)應經(jīng)常變換視野。

　　七、亦可用uvFL10或uvFL20低倍鏡鏡檢材料(用低倍鏡時(shí)不加無(wú)熒光油)。

　　熒光圖像的記錄方法：

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時(shí)，必須將二者結合起來(lái)綜合判斷。結果記錄根據主觀(guān)指標，即憑工作者目力觀(guān)察。作為一般定性觀(guān)察，基本上可靠的。隨著(zhù)技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀(guān)指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀(guān)的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統裝置。

　　注意事項：

　　(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

　　(2)應在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開(kāi)始觀(guān)察標本。

　　(3)防止紫外線(xiàn)對眼睛的損害，在調整光源時(shí)應戴上防護眼鏡。

　　(4)檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線(xiàn)照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過(guò)2～3h。

　　(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節 省時(shí)間，保護光源。天熱時(shí)，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應避免數次點(diǎn)燃光源。

　　(6)標本染色后立即觀(guān)察，因時(shí)間久了熒光會(huì )逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　　(7)熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光�！�+”—僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光�！�++”—可見(jiàn)有明亮。