熒光顯微鏡原理與標本的制作方法

　　熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學(xué)系統等主要部件組成。是利用一定波長(cháng)的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統放大以觀(guān)察標本的熒光圖像

　　(一)光源

　　現在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達50～70個(gè)標準大氣壓力，這一過(guò)程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

　　超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。

　　新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后，則需要高壓?jiǎn)��?dòng)(約為15000V)，啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開(kāi)動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開(kāi)一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數。燈泡在使用過(guò)程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線(xiàn)強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。

　　超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調節燈泡發(fā)光中心的系統，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。

　　國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡，平均壽命在200h以上，價(jià)格也比較低。

　　我國研制的一種簡(jiǎn)易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用(自帶直流電源)，易于攜帶，使用方便，已推廣應用。

　　(二)濾色系統

　　濾色系統是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠(chǎng)家名稱(chēng)常不統一。濾板一般都以基本色調命名，前面字母代表色調，后面字母代表玻璃，數字代表型號特點(diǎn)。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母;我國產(chǎn)品的名稱(chēng)已統一用拼音字母表示，如相當于BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色(藍色)拼音的第一個(gè)字母，B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。不過(guò)有的濾板也可以透光分界濾長(cháng)命名，如K530，就是表示壓制濾長(cháng)530nm以下的光而透過(guò)530nm以上的光。還有的廠(chǎng)家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠(chǎng)的NO：5-58，即相當于BG12。

　　1.激發(fā)濾板根據光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(cháng)范圍的激發(fā)光。

　　紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

　　紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內的光通過(guò)。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

　　紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型號為QB24(BG12)。

　　最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如B-7)激發(fā)。

　　近年開(kāi)始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長(cháng)適當，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠(chǎng)的FITC專(zhuān)用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。

　　激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些�；�本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。

　　2.壓制濾板壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，提供相應濾長(cháng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：

　　紫外光壓制濾板：可通過(guò)可見(jiàn)光、阻擋紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

　　紫藍光壓制濾板：能通過(guò)510nm以上濾長(cháng)的熒光(綠到紅)，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

　　紫外紫光壓制濾板：能通過(guò)460nm以上波長(cháng)的熒光(藍到紅)，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K510。

　　(三)反光鏡

　　反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見(jiàn)光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。

　　(四)聚光鏡

　　專(zhuān)為熒光顯微鏡設計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

　　1.明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀(guān)察。

　　2.暗視野聚光器暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無(wú)色濾板(不透過(guò)紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀(guān)察舒適，可能發(fā)現亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。

　　3.相差熒光聚光器相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀(guān)察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀(guān)察很少需要這種聚光器。

　　(五)物鏡

　　各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長(cháng)范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時(shí)其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡(4×,5×，6.3×等)。

　　(六)目鏡

　　在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過(guò)去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀(guān)察很方便。

　　(七)落射光裝置

　　新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后，波長(cháng)短的部分(紫外和紫藍)由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長(cháng)長(cháng)的部分(綠、黃、紅等)，對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見(jiàn)光長(cháng)波區，可透過(guò)濾鏡而到達目鏡觀(guān)察，熒光圖像的亮度隨著(zhù)放大倍數增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀(guān)察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱(chēng)之為落射熒光顯微鏡。

　　二、熒光顯微鏡標本制作要求

　　(一)載玻片

　　載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

　　(二)蓋玻片

　　蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長(cháng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標本。

　　(三)標本

　　組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀(guān)察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

　　(四)封裱劑

　　封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

　　(五)鏡油

　　一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀(guān)察標本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。

　　三、使用熒光顯微鏡的注意事項

　　(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

　　(2)應在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開(kāi)始觀(guān)察標本。

　　(3)防止紫外線(xiàn)對眼睛的損害，在調整光源時(shí)應戴上防護眼鏡。

　　(4)檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線(xiàn)照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過(guò)2～3h。

　　(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時(shí)間，保護光源。天熱時(shí)，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應避免數次點(diǎn)燃光源。

　　(6)標本染色后立即觀(guān)察，因時(shí)間久了熒光會(huì )逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　　(7)熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光�！� ”—僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光�！� ”—可見(jiàn)有明亮的熒光�！� ”—可見(jiàn)耀眼的熒光。

　　四、熒光圖像的記錄方法

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時(shí)，必須將二者結合起來(lái)綜合判斷。結果記錄根據主觀(guān)指標，即憑工作者目力觀(guān)察。作為一般定性觀(guān)察，基本上可靠的。隨著(zhù)技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀(guān)指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀(guān)的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統裝置。標本的制作方法樣品須經(jīng)過(guò)石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀(guān)察效果還可以.

　　作熒光觀(guān)察需用熒光染料DAPI染色，

　　石蠟切片的過(guò)程：

　　1.取材:刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm,大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜.取材時(shí)間越快越好.

　　2.固定:組織取下后應立即放入10%福爾馬林(相當于4%甲醛)固定.

　　注意:(1).固定液量應為組織塊體積的40倍.

　　(2)固定時(shí)間固定時(shí)間與使用的固定液種類(lèi)和組織塊大小,溫度等有關(guān).一般為3—24h.

　　(3)固定溫度大多可在室溫固定,在低溫(4℃)時(shí)間應延長(cháng).

　　(4)固定容器應大些.

　　3.漂洗:流水沖洗2—10h.

　　4.脫水:從低濃度酒精到高濃度酒精.

　　70%(數分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).

　　5.透明:組織塊脫水后必須經(jīng)過(guò)一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑,而使石蠟進(jìn)入組織塊.常用二甲苯,一般浸泡30m即可.

　　6.浸蠟:組織經(jīng)透明后在熔化的石蠟內浸漬的過(guò)程稱(chēng)浸蠟.一般需經(jīng)2—3次浸漬才能完成,總時(shí)間為3—4h.用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52—56℃.

　　7.包埋:先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入.包埋面必須平整.包埋后石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

　　8.切片:修塊→切片→展片→撈片→烤片.

　　也可作冰凍切片.

　　熒光染料的配制：

　　儲藏液：1mg/mldapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

　　工作液：通常1μg/ml

　　染色時(shí)須避光，10min左右

　　用pbs沖去多余染液即可觀(guān)察。