水產(chǎn)品獸藥殘留快速分析

 

水產(chǎn)品獸藥殘留快速分析

1 水產(chǎn)品藥殘概論

藥物在預防、治療水產(chǎn)疾病中起到積極作用，但同時(shí)又帶來(lái)了藥物殘留(簡(jiǎn)稱(chēng)藥殘)問(wèn)題。目前，水產(chǎn)品藥物殘留問(wèn)題日益嚴重，它不僅對人體健康造成潛在危害，而且還影響著(zhù)水產(chǎn)品進(jìn)出口貿易，已成為出口貿易的瓶頸，因此加強水產(chǎn)品藥物殘留監管，提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全已是刻不容緩。

1．         水產(chǎn)品藥物殘留的定義

水產(chǎn)品藥物殘留是指對人體健康產(chǎn)生重大影響的，在水產(chǎn)品的任何食用部分中，藥物的原型化合物或者其代謝產(chǎn)物，及與藥物本體有關(guān)雜質(zhì)的殘留。主要的殘留藥物有消毒劑、驅殺蟲(chóng)劑、抗菌藥(抗生素、磺胺類(lèi)、呋喃類(lèi))、激素類(lèi)、基因誘導劑、疫苗等。

2．  水產(chǎn)品藥物殘留對人體的危害

對于大多數人們來(lái)說(shuō)，主要是通過(guò)食用帶有殘留獸藥的水產(chǎn)食品，這種接觸幾乎每天都有，是長(cháng)期的。水產(chǎn)品藥物殘留對人體的危害主要有以下幾個(gè)方面：

（1）       人類(lèi)細菌耐藥性增加

   目前漁用抗菌藥物使用范圍和劑量的日益擴大，抗菌藥藥性殘留于水產(chǎn)動(dòng)物食品中，同樣使人長(cháng)期與藥物接觸，導致人體現人耐藥菌的增加，耐藥性的增強�，F已研究證實(shí)細菌的耐藥性可以通過(guò)耐藥質(zhì)粒在人群中細菌、動(dòng)物群中細菌和生態(tài)系統中細菌間相互傳遞，導致致病菌產(chǎn)生耐藥性。

  （2）毒性損傷

藥物殘留可通過(guò)食物鏈長(cháng)期富集而對人體造成一定程度的損傷。如：硝酸亞汞、甘汞等制品對魚(yú)類(lèi)小瓜蟲(chóng)的治療效果好，但其在魚(yú)體內易富集、殘留，當人攝入后可引起腎損傷，表現為變性和壞死，引起腎功能降低。一些抗生素的長(cháng)期使用和濫用在水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)品的殘留也會(huì )造成一些潛在的危害。如：氯霉素可抑制骨髓造血功能，引起再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥；呋喃唑酮可引起溶血性貧血、多發(fā)性神經(jīng)炎和急性肝壞死等；四環(huán)素類(lèi)可抑制幼兒牙發(fā)育和骨骼生長(cháng)；鏈霉素等氨基糖甙類(lèi)抗生素損傷聽(tīng)神經(jīng)和腎功能。

（3）過(guò)敏反應或變態(tài)反應

   磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和某些基糖甙類(lèi)抗生素等藥物殘留于水產(chǎn)動(dòng)物性產(chǎn)品中進(jìn)入人體后，就使得敏感個(gè)體致敏，產(chǎn)生抗體。當這些被致敏的個(gè)體再次接觸這些抗生素時(shí)，則這些抗生素會(huì )與抗體結合生成抗原抗體復合物，激活體內肥大細胞和嗜堿性粒細胞，釋放組胺、ECF-A、LTS、PG和PAF等物質(zhì)刺激，集體出現平滑肌痙攣、身管擴張、微血管通透性增加、組織水腫、粘膜腺體分泌等病理?yè)p傷。過(guò)敏反應或變在臨床上輕者可表現為有瘙癢的蕁麻疹、惡心嘔吐、腹痛腹瀉，重者表現為血壓急劇下降、迅速引起過(guò)敏性休克，甚至死亡。如磺胺類(lèi)藥物可引起人類(lèi)的皮炎、血細胞減少、溶血性貧血和藥熱等臨床癥狀。

（4）三致作用

即致癌、致畸、致突變作用。藥物及環(huán)境中的化學(xué)藥品可引起基因突變或染色體畸變而造成對人類(lèi)的潛在危害。如水產(chǎn)常用促生長(cháng)劑喹乙醇，現已證實(shí)有明顯的蓄積毒性、遺傳毒性和誘變性。長(cháng)時(shí)間使用會(huì )在魚(yú)體內殘留，而對人的健康造成潛在的威脅，因此對于喹乙醇用于水產(chǎn)的安全性需進(jìn)一步評價(jià)。水產(chǎn)上常用的治療水霉病的藥物孔雀石綠，是一種強致癌物。據報道魚(yú)體短期一次接觸孔雀石綠1/15000濃度，就可致細胞突變，現在許多國家和組織已禁止使用。硝基呋喃類(lèi)藥物（如呋喃唑酮、呋喃西林）近來(lái)的研究認為長(cháng)期使用除了會(huì )對肝、腎造成損傷外，同時(shí)具有致癌作用和致畸、致突變效應。做為水產(chǎn)上常用的消毒藥二氯異氰尿酸鈉和三氯異氰尿酸過(guò)去認為是安全、高效的消毒藥，但近來(lái)研究證實(shí)其在水體中的分解產(chǎn)物氰尿酸降解速度非常緩慢，且對人體有致癌作用。此外在水產(chǎn)上常用的殺蟲(chóng)藥敵百蟲(chóng)、促生長(cháng)劑乙烯雌酚、砷制劑等都已證明具有致癌作用。許多國家都已禁止這些藥用于水產(chǎn)養殖。當人們長(cháng)期食用含有三致作用藥物殘留的動(dòng)物性食品時(shí)，這些殘留物便會(huì )對人體產(chǎn)生危害，或在人體內蓄積，最終產(chǎn)生致癌、致畸、致突變作用。近年來(lái)人群中腫瘤發(fā)生率不斷升高，人們懷疑與環(huán)境污染及動(dòng)物性食品中藥物殘留有一定關(guān)系。

  3．  水產(chǎn)品藥物殘留控制的意義

由于水產(chǎn)養殖藥物殘留具有三致作用、毒性損傷、激素樣作用等危害，嚴重威脅人體健康，已成為人類(lèi)的隱形殺手。近幾年我國出口的水產(chǎn)品因藥物殘留問(wèn)題屢遭禁運，首先是2001年9月，歐盟因氯霉素殘留問(wèn)題將我國出口到歐盟的凍蝦產(chǎn)品納入快速預警機制； 2002年3月，日本厚生省對我國出口到日本的動(dòng)物源性產(chǎn)品實(shí)行嚴檢，并向我方通報從福建進(jìn)口的鰻魚(yú)產(chǎn)品中檢出大量氯霉素殘留，同時(shí)公布了11種藥物的最大殘留限量。2006年上海市質(zhì)量監督局從山東產(chǎn)的大鯪鲆中檢測出硝基呋喃類(lèi)代謝物超標，全國一片嘩然。由此可見(jiàn)，我國從保障人民群眾健康，水產(chǎn)養殖業(yè)要持續健康發(fā)展，水產(chǎn)品要進(jìn)入國際市場(chǎng)的需要，必須嚴格控制藥物殘留。 

4．  水產(chǎn)養殖中藥物殘留的控制措施

⑴根據藥物在水產(chǎn)動(dòng)物體內的藥代動(dòng)力學(xué)規律合理用藥。

⑵開(kāi)展多種形式的教育工作，提高全民關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物食品安全性的整體認識，引導水產(chǎn)養殖者科學(xué)用藥，推廣健康養殖技術(shù)。

⑶加強和完善我國漁藥殘留的監控體系。

a.建立和完善水產(chǎn)品的安全保障體系，依法開(kāi)展水產(chǎn)品無(wú)公害臨界控制的檢驗檢疫工作。

b.加強藥物殘留的方法和標準建設，在標準制定中要突出水產(chǎn)品安全衛生標準、質(zhì)量標準、漁藥使用規范、藥物殘留限量及相應的檢測技術(shù)和檢測方法的制定。

c.加快縣市一級藥物殘留檢測機構的建立和建設，使之形成從完善的藥物殘留檢測網(wǎng)絡(luò )機構，便于開(kāi)展水產(chǎn)品中藥物殘留的常規檢測，加強藥物殘留的監控力度。

2 水產(chǎn)品藥殘分析原理

1．水產(chǎn)品藥殘快速檢測的構成要素

相應的檢測儀器（酶標儀或專(zhuān)業(yè)分析儀TR-300）、樣品前處理工具和檢測試劑盒。

2．檢測原理

采用免疫競爭法定量。微量反應板上包被有羊抗兔抗體，檢測時(shí)加入特異性的待檢藥殘抗體、待檢藥殘標準品或待測樣品溶液及辣根過(guò)氧化物酶標記的藥殘結合物溶液，室溫（25℃）下反應，待測藥殘標準品或樣品溶液及過(guò)氧化物酶偶聯(lián)待測藥殘結合物競爭性地與待測藥殘抗體結合，形成抗原抗體復合物。洗滌后加酶反應底物和顯色劑，結合的酶標記物將無(wú)色的顯色劑轉化為藍色的產(chǎn)物。加入反應終止液后使顏色由藍色變?yōu)辄S色，在450nm處測量吸光度值，樣品中的待測藥殘濃度與吸光度值成反比。

 

3 我國的分析標準

我國現行獸藥殘留分析的標準分兩類(lèi)，一類(lèi)是國家標準，一類(lèi)為農業(yè)部的檢測方法，快速分析大多為農業(yè)部的檢測方法。

4 應用及測試步驟

1．應用

水產(chǎn)品藥殘快速分析主要有兩個(gè)方面的應用，第一是為了適應大量水產(chǎn)品的常規檢測，對于各級水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測機構需要快速檢測法，即使用快速檢測法對大量樣本進(jìn)行初步篩選，再對初篩中具有超出農業(yè)部限量的結果的樣本進(jìn)行實(shí)驗室驗證，如應用HPLC、GC、MS、HPLC-MS等進(jìn)行進(jìn)一步測定。第二是為了適應隨時(shí)隨地的快速檢測，對于縣市一級的水產(chǎn)品檢測機構，漁業(yè)合作社、水產(chǎn)公司、水產(chǎn)批發(fā)市的質(zhì)量監管部門(mén)需要快速檢測法，即在短時(shí)間內對樣本作出判斷，將具有超出農業(yè)部限量結果的產(chǎn)品阻止在流通環(huán)節之外。

典型用戶(hù)類(lèi)型

1 海洋與漁業(yè)廳/市縣局的水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心、水產(chǎn)種苗監督管理站

2  衛生廳/衛生監督所

3  人民政府食品辦公室

4  內地水利水產(chǎn)局/水產(chǎn)股/漁政

5  產(chǎn)品質(zhì)量監督檢驗所

6  出入境檢驗檢疫部門(mén)

7  食品質(zhì)量監督檢測機構

8  工商局流動(dòng)檢測車(chē)

9  水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)

10 農貿市場(chǎng)

11 大型廠(chǎng)礦

12 企事業(yè)單位

13 飯店，賓館，超市

……

2． 我公司關(guān)于水產(chǎn)品藥殘快速測試步驟

 （1）樣品前處理（以氯酶素藥殘為例）

 

水產(chǎn)品（肉類(lèi)）藥殘富集、提取器操作

------前處理氯酶素藥殘

 

一、  器具準備

1．  水產(chǎn)品（肉類(lèi)）藥殘富集、提取器；

2．  離心機：4000rpm，6孔20ml角轉子；

3．  20-200 ,100-1000μl數字可調移液槍各一支；

4．  手掌天平：100/0.01 g；

5．  組織均質(zhì)器：2000-11000轉/分；

6．  組織攪拌器：500轉/分；

7．  10 ml具蓋塑料離心管若干、20ml塑料離心管12個(gè)，50 ml若干塑料離心管4個(gè)；

8．  手術(shù)剪刀一個(gè)

9．  試劑：

   乙酸乙酯（分析純），100ml貯瓶；正已烷（分析純），100 ml貯瓶；已稀釋的組織樣品萃取劑，50 ml貯瓶。

二、組織樣品制備                                     

     稱(chēng)取100g去除皮、筋膜的魚(yú)脊背肉組織，用手術(shù)剪刀按2х2cm剪成塊，放入組織均質(zhì)器中，每5秒一次，直至打成肉泥。

三、組織樣品藥殘提取、富集

1．稱(chēng)取1g均質(zhì)好的組織樣品于10 ml具蓋塑料離心管中，離心管置于提取架上，用移液槍吸取6000μl乙酸乙酯于離心管內，離心管上蓋。

2．在藥殘富集、提取儀上，設定倒置計時(shí)時(shí)間為5分鐘，倒入38℃左右熱水于水浴器內1/2，超聲發(fā)生系統開(kāi)啟，放入離心管，倒置計時(shí)時(shí)間為0時(shí)取出離心管。

3．離心管放入離心機中，2500 rpm離心8分鐘。

4．用移液槍吸取4000μl上清液于另一離心管中，置于藥殘富集、提取儀吹淋系統架上，吹淋管放入離心管中（注意不能接觸離心管內液面），打開(kāi)氣源發(fā)生器減壓開(kāi)關(guān)，調節吹淋系統壓力為0.0015kg，50℃恒溫吹干，過(guò)程約3分鐘。

5．移液槍吸取1000μl正已烷（分析純），溶解吹干后的離心管剩余物，超聲2分鐘，再吸取500μl已稀釋的組織樣品萃取劑加入離心管內，繼續超聲1分鐘。

6．超聲完畢的離心管放入離心機中，離心管上蓋，2500 rpm離心8分鐘，下層液相用于檢測。

樣品前處理完畢。

  （2）樣品檢測

      藥殘快速分析儀操作------氯酶素藥殘

                       

一、檢測儀器操作

開(kāi)啟藥殘快速分析儀，進(jìn)入“藥殘快速分析”界面。

第一步 編程

 點(diǎn)擊“編程”，  進(jìn)入編程界面，進(jìn)行項目設定，點(diǎn)擊“下級”進(jìn)入編程

1．  項目名稱(chēng)和檢測編號設定，

2．  下一級“波長(cháng)”單、雙波長(cháng)選擇，

3．  下一級“樣品”單、雙樣和標準雙樣設定，

4．  下一級“檢測方式”設定（吸光度值，定量檢測），

5．  下一級“報告方式”設定（濃度值、正常值、稀釋倍數），

6．  下一級“孔位設置”（空白、質(zhì)控、標準孔）。 

7．  下一級 “參數輸入”（梯度標準值、單位、正常值/限量判定）

8．  編程結束，貯存。            

第二步 點(diǎn)擊“檢測”進(jìn)入檢測界面

找到要檢測的項目和編號，進(jìn)入該項目

進(jìn)行檢測。

板孔設定如下（檢測雙樣）

     

            S=標準樣品      T=測試樣品

S1	S1-1	T1	T1-1	T9	T9-9	T17	T17-17	T25	T25-25	T33	T33-33
S2	S2-2	T2	T2-2	T10	T10-10	T18	T18-18	T26	T26-26	T34	T34-34
S3	S3-3	T3	T3-3	T11	T11-11	T19	T19-19	T27	T27-27	T35	T35-35
S4	S4-4	T4	T4-4	T12	T12-12	T20	T20-20	T28	T28-28	T36	T36-36
S5	S5-5	T5	T5-5	T13	T13-13	T21	T21-21	T29	T29-29	T37	T37-37
S6	S6-6	T6	T6-6	T14	T14-14	T22	T22-22	T30	T30-30	T38	T38-38
		T7	T7-7	T15	T15-15	T23	T23-23	T31	T31-31	T39	T39-39
		T8	T8-8	T16	T16-16	T24	T24-24	T32	T32-32	T40	T40-40

 

標板設定按圖4，根據檢測量，可全選或部分選，標板設定完畢后，待檢測操作完成后，點(diǎn)擊“開(kāi)始”進(jìn)行檢測。

二、加樣記錄準備                

待所有試劑的溫度回復至室溫（約19℃至25℃）方可使用。為了減低邊緣效應，建議在反應過(guò)程中用標板密封膠片將標板密封。每個(gè)標準或樣品要做兩份平行試驗，并做好加樣位置的記錄。

三、檢測操作

1．用移液槍吸取標準或樣品25ul，分別加入到指定的微孔中，然后加入100ul酶標記物到每一個(gè)微孔中，用密封膠紙把反應板蓋住。

2．左右輕敲反應板邊緣數秒，將其置于室溫下（19℃～25℃）培養1小時(shí)。翻轉反應板，使孔內所有液體傾出。

3．吸取已稀釋的洗滌緩沖劑250—300ul洗滌反應板4次，每次洗滌時(shí)，將所有液體輕輕倒出、拍干。

4．立刻用移液槍移取125μl單組分底物/發(fā)色劑到每一孔里。完畢后，左右輕敲反應板，將其放在避光處（約20℃至25℃）20±2分鐘。

5．加入100μl0.2M硫酸終止反應，反應物的顏色會(huì )由藍色轉為黃色。

6．在10分鐘內，上藥殘分析儀，測定，打印結果。

5 國內水產(chǎn)品藥殘快速檢測市場(chǎng)分析

   1．檢測形式分析

   目前國內水產(chǎn)品藥殘分兩種檢測形式，第一種為“兩步法”，即酶標儀法，利用醫療檢測設備酶標儀對水產(chǎn)品藥殘進(jìn)行（OD值）的比色，測出OD值后，或利用電子計算器進(jìn)行半對數計算，或利用試劑廠(chǎng)家提供的計算小軟件進(jìn)行數據整理，再求反對數結果；第二種為“一步法”，即專(zhuān)用藥殘分析儀法，利用專(zhuān)用藥殘分析儀，檢測結果直接求出，并配有標準曲線(xiàn)圖形，相關(guān)系數，回歸線(xiàn)性方程的斜率和截距，檢測一目了然。（對于政府部門(mén)對于水產(chǎn)品藥殘的市場(chǎng)管理，可設定出農業(yè)部的限量標準，檢測結果直接顯示和判定是否超標）

   雖然有的酶標儀廠(chǎng)家也給出了定量計算公式，但由于檢測試劑不同，稀釋倍數不同，也沒(méi)辦法直接得出結果。

2．前處理工具分析

以往水產(chǎn)品藥殘快速檢測項目，政府或用戶(hù)招標采購后，酶標儀只做為終端機使用，最多配幾只移液器，往往忽略前處理工具的采購，二次采購需要增加德國進(jìn)口均漿機，氮吹儀，震蕩器，培養箱等設備，增加很大成本，且儀器設備多而笨重，實(shí)現不了便攜現場(chǎng)檢測。

    GZTRAD水產(chǎn)品藥殘快速檢測儀的前處理采用超聲萃取技術(shù)，所用設備為模塊化的藥殘快速富集提取器，前處理設備和檢測儀器集中在兩個(gè)工具箱內，可實(shí)現便攜現場(chǎng)檢測。

6 GZTRAD水產(chǎn)品（肉類(lèi)）藥殘快速檢測儀特點(diǎn)

1. 見(jiàn)宣傳材料。

2. 定標曲線(xiàn)帶曲線(xiàn)修正功能，很大程度上避免了檢測試劑對檢測結果的影響。

3. 標準曲線(xiàn)的存貯，節省昂貴的檢測試劑。同一檢測試劑，最少可進(jìn)行一個(gè)樣品的檢測，最多可進(jìn)行84個(gè)樣品檢測，而不用再做定標曲線(xiàn)。

7        藥殘快速分析儀儀器維護及質(zhì)量保證

1．儀器維護

1．1概述

本儀器在正常使用過(guò)程中,只需正常的清潔維護即可，但以下部件經(jīng)長(cháng)時(shí)間工作后，可能會(huì )出現失效或故障，請到指定維修點(diǎn)維修或請用戶(hù)在專(zhuān)業(yè)人員指導下進(jìn)行維修。為了使儀器保持一個(gè)良好的狀態(tài)，必須做好日常維護工作。

警告：儀器的維修需要專(zhuān)業(yè)人員操作，在維修或其他原因拆卸外殼時(shí)必須切斷電源，并且閉主機。

1.2 清潔儀器

    1）保持儀器工作環(huán)境的清潔。

2）儀器表面的清潔，可以用中性清潔和濕布擦試。

3）液晶顯示器請用柔軟的布清潔。

警告：請勿讓任何溶劑、油脂類(lèi)、腐蝕性物質(zhì)接觸儀器。

1.3 儀器部件更換

1.3.1 更換保險絲

1）  關(guān)閉電源開(kāi)關(guān)。

2）保險絲安裝在儀器后面電源開(kāi)關(guān)旁邊的保險絲盒中，擰開(kāi)保險盒十字螺釘，更換同種規格的保險絲。保險絲規格：φ5×20  250V、2A。

1.3.2 更換濾光片

濾光片經(jīng)過(guò)一段使用后，基透射率會(huì )有所下降。當下降到儀器不能正常工作時(shí)，儀器會(huì )自動(dòng)給出顯示，提醒用戶(hù)及時(shí)更換。更換方法如下：打開(kāi)儀器上蓋，找到濾光盤(pán)，查到失效的濾光片，取出已失效的舊片，換上新片即可。

1.3.3 更換光源燈

當光源燈損壞時(shí)，儀器也會(huì )自動(dòng)給出顯示，這時(shí)可打開(kāi)儀器上蓋，經(jīng)檢查確定是燈泡損壞時(shí)，拔下燈插座，用手輕輕由下向上取出燈泡，更換上新的同規格燈即可。如果更換新燈泡后，儀器仍指示有故障，請及時(shí)通知本公司專(zhuān)業(yè)人員前去調試。

1.4 簡(jiǎn)單故障處理

現    象	原     因	解  決  方  案
儀器不能啟動(dòng)	電源不正常	檢查是否通電，電源插頭不否松脫，保險絲是否斷路，電源電壓是否合格。
托盤(pán)運動(dòng)不正常	步進(jìn)電機引線(xiàn)插接不良；同步帶松脫；運動(dòng)部件移位卡住支，定位光耦松脫或損壞	校正傳動(dòng)機構，請專(zhuān)業(yè)人員調整。重新檢查各聯(lián)接線(xiàn)，擰緊松動(dòng)光耦。
自檢不正常	光系統故障；波長(cháng)設置不對	查看光源燈是否亮，重新設置一次系統的波長(cháng)值。
檢測結果不正確	光源燈和濾光片老化	及時(shí)更換新的光源燈和濾光片
打印機燈常閃	打印機接收故障，傳送數據出錯	關(guān)掉打印機電源，等一會(huì )再打開(kāi)；更換打印控制板

 

2． 質(zhì)量承諾

    從發(fā)貨之日起一年內，本儀器若因質(zhì)量問(wèn)題不能正常工作，本公司將無(wú)償為用戶(hù)修理或更換元器件或更換該產(chǎn)品。對于違反規定或者用戶(hù)自拆卸導致儀器損壞，則須收取維修工本費，一年以后，本公司負責該儀器的終身維護。