如何選擇紫外/可見(jiàn)分光光度計

  
一、分光光度計的工作原理
  分光光度法是根據被測物質(zhì)分子對紫外、可見(jiàn)波段范圍單色輻射的吸收或反射強度來(lái)進(jìn)行物質(zhì)的定性、定量或結構分析的一種方法。
  物質(zhì)呈現特征的顏色，這是由于它們對可見(jiàn)光中某些特定波長(cháng)的光線(xiàn)選擇性吸收的緣故。實(shí)際上，一切物質(zhì)都會(huì )對可見(jiàn)光和不可見(jiàn)光中的某些波長(cháng)的光線(xiàn)進(jìn)行吸收。但是，一切光線(xiàn)并不都是以相同的程度被物質(zhì)吸收的。物質(zhì)對不同波長(cháng)的光線(xiàn)表現不同的吸收能力，叫做選擇性吸收。各種物質(zhì)對光線(xiàn)的選擇性吸收這一性質(zhì)，反映了它們分子內部結構的差異，即各種物質(zhì)的內部結構決定了它們對不同光線(xiàn)的選擇吸收。
  朗伯-比耳定律 （Lambert-Beer）是幾乎所有的光學(xué)分析儀器的基本工作原理，它由朗伯定律和比耳定律合并而成。 
          朗伯定律表明：如果溶液的濃度一定，則光對物質(zhì)的吸收程度與它通過(guò)的溶液厚度成正比。 
          比耳定律表明：如果吸光物質(zhì)溶于不吸光的溶劑，則吸光度和吸光物質(zhì)的濃度成正比。 
兩者合成后的數學(xué)表達式如下： 
      T=I/I。 （1） 
      A=KCL=‐㏒ I/Io （2） 
其中 
    T 透過(guò)率 
    A 吸光度 
    C 溶液濃度 
    K 溶液的吸光系數 
    L 液層在光路中的長(cháng)度  
    I 光透過(guò)被測試樣后照射到光電轉換器上的強度 
    Io 光透過(guò)參比測試樣后照射到光電轉換器上的強度 

二、產(chǎn)品類(lèi)型結構：

光度計
      可見(jiàn)分光光度計  
           紫外/可見(jiàn)分光光度計    
                 掃描型紫外/可見(jiàn)分光光度計
                        雙光束紫外/可見(jiàn)分光光度計 

三、儀器技術(shù)參數解釋
     波長(cháng)范圍：儀器可選波長(cháng)的測量范圍。不同的物質(zhì)吸收所對應的吸收波長(cháng)不一樣。 
    氘燈：紫外光源                    185-400nm 
    鎢燈：可見(jiàn)和近紅外光源      250---2000nm              
   光譜帶寬：目前國際上對光譜帶寬的測試方式一般用“譜線(xiàn)輪廓法”，主要是選用某些光源的特征譜線(xiàn)，對它進(jìn)行光譜掃描，繪出該譜線(xiàn)的輪廓，再測出該譜線(xiàn)的半峰高的寬度即為光譜帶寬（又稱(chēng)自然光譜帶寬）。儀器使用的光譜帶寬通常要比自然光譜帶寬小10倍以上。
    波  長(cháng)  準  確  度：也叫波長(cháng)精度，是波長(cháng)的實(shí)際測定值與理論值的差值。
   波  長(cháng)  重  復  性：多次測量（一般是3次）最大值與最小值之間的差值。
   光  度  準  確  度：光度測量值與光度理論值之差。 
   影響光度準確度的主要因素： 
      ①雜散光      ②光度噪聲      ③基線(xiàn)平直度 
      ④光譜帶寬  ⑤試樣來(lái)源      ⑥試樣制備 
      ⑦比色皿 
   光  度  重  復  性：多次測量（一般是3次）最大值與最小值之間的差值。  
   影響光度重復性的主要因素： 
      ①光源系統（氘燈、鎢燈）       
      ②光電轉換器系統 
      ③電源系統       
      ④環(huán)境 
  雜    散    光：不同于測試所需要的波長(cháng)的光叫做雜散光。 

影響雜散光的主要因素： 
  ①灰塵沾污光學(xué)元件   ②隔板邊緣的反射 
  ③光學(xué)系統屏蔽不好   ④狹縫的缺陷 
  ⑤光束孔徑不匹配       ⑥光學(xué)系統的像差 
  ⑦單色器內壁黑化處理不當   等等 

      雜散光對分析測試結果的誤差影響是隨著(zhù)吸光度值增大而增大的，會(huì )使結果偏離比耳定律。 
       
      ·雜散光被試樣吸收時(shí)，偏離是正值。 
      ·雜散光不被試樣吸收時(shí)，偏離是負值。  

穩    定    性：穩定性包括基線(xiàn)漂移和光度重復性。 
       
基線(xiàn)漂移是指冷態(tài)開(kāi)機預熱2小時(shí)后調零，試劑和參比比色皿都為空氣，在固定波長(cháng)（500nm）下連續測定吸光度1小時(shí)，最大值和最小值之差。 
光度噪聲（噪聲）： 
      
       噪聲是指冷態(tài)開(kāi)機預熱0.5小時(shí)后調零，試劑和參比比色皿都為空氣，在500nm下連續測定吸光度1小時(shí)，偏離零點(diǎn)的最大值。 
      基線(xiàn)平直度： 
      基線(xiàn)平直度是指冷態(tài)開(kāi)機預熱0.5小時(shí)后調零，從長(cháng)波長(cháng)向短波長(cháng)對儀器進(jìn)行全波長(cháng)慢速掃描吸光度，偏離零點(diǎn)的最大值。 
吸光度和透過(guò)率的關(guān)系：透過(guò)率和吸光度是一一對應的關(guān)系，關(guān)系式如下： 
A=2 – lgT% 
其中    A為吸光度 
           T為透過(guò)率 
        若T=100%，A = 2 - lg100 = 2 - 2 = 0 
        若T=10%  ，A = 2 - lg10   = 2 - 1 = 1 
光度分析：固定波長(cháng)下測定樣品的吸光度和透過(guò)率。 

定量分析：通過(guò)對已知濃度的樣品進(jìn)行吸光度的測定，制作標準曲線(xiàn)，得出曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程C=KA+b。再測定未知樣品的吸光度，通過(guò)線(xiàn)性方程求出樣品的濃度。 
動(dòng)力學(xué)測試：固定波長(cháng)下，測定樣品在一段時(shí)間內吸光度或透過(guò)率的變化圖譜，可計算樣品的反應率△A/t。 
       
    需設定的參數： 
         掃描時(shí)間，最多9小時(shí)； 
         采樣間隔，最小為0.5秒； 
         延時(shí)時(shí)間 
         掃描波長(cháng) 
全波長(cháng)掃描：在儀器波長(cháng)范圍內，設定任意波長(cháng)區間，對未知試樣進(jìn)行吸光度、透過(guò)率的圖譜掃描。 
       
     需設定的參數： 
         掃描波長(cháng)范圍 
         掃描間隔，0.1、0.2、0.5、1、2、5nm； 
         掃描速度，建議為低速； 
         T/A模式 
圖譜處理 
     圖譜放大、縮小、峰谷檢測、平滑等處理； 
     圖譜存儲和調用； 
     使用PC版軟件可進(jìn)行1-4階求導、四則運算、疊加等分析。
多波長(cháng)測試：對某一待測物質(zhì)在多個(gè)波長(cháng)點(diǎn)進(jìn)行吸光度、透過(guò)率測試。 
  
    單機版可測試10個(gè)波長(cháng)點(diǎn)； 
      PC版可測試32個(gè)波長(cháng)點(diǎn)。
DNA/蛋白質(zhì)測試 
    測試波長(cháng)缺省值為260、280、320nm，可修改。 
    可計算DNA、Protein的濃度和Ratio。 

單光束分光光度計特點(diǎn)：結構簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜 

雜散光、光度噪聲、光譜帶寬等主要技術(shù)指標差，不適合用于技術(shù)要求較高的行業(yè)，如制藥、科研、質(zhì)量檢驗行業(yè)。 
準雙光束分光光度計特點(diǎn)：結構較簡(jiǎn)單、價(jià)格較便宜。 
有一束作為參考光束，能部分抵消光源振動(dòng)、電子學(xué)噪聲，以提高儀器的穩定性。 
只有一個(gè)比色皿，不能抵消雜散光。
雙光束雙轉換器分光光度計特點(diǎn)：能部分抵消光源波動(dòng)、雜散光、電噪聲的影響，光度準確好； 
結構較復雜、價(jià)格昂貴； 
因一束光分為兩束，每束光的能量低，信噪比不如單光束光度計好； 
兩個(gè)轉換器不能完全匹配，故掃描測量誤差大，不建議用來(lái)做光譜掃描。
雙光束單檢測器分光光度計特點(diǎn)：能部分抵消光源波動(dòng)、雜散光、電噪聲的影響，光度準確好、技術(shù)指標很先進(jìn)； 
結構較復雜、價(jià)格昂貴； 
因一束光分為兩束，每束光的能量低，信噪比不如單光束光度計好。但兩束光路對噪聲可相互抵消，靈敏度仍然很好。 

四、分光光度計的評價(jià)和挑選：
    適用性 
    可靠性 
    智能型 
    經(jīng)濟性 
    美學(xué)性 
    工藝性 
適    用    性：適用性—滿(mǎn)足使用要求的程度，主要由技術(shù)指標所決定。 
波長(cháng)準確度： 
對于一般的定量分析，波長(cháng)準確度不是很重要； 
對不同試樣進(jìn)行比對測試時(shí)，波長(cháng)準確度就相當重要。 

雜散光： 
      在分析的試樣較多，濃度較大時(shí)很重要。 

雜散光一定時(shí)，分析測試的數據會(huì )隨著(zhù)濃度的增大，偏離比耳定律的程度就越大，故對待測試樣的濃度上限有嚴格要求； 
分析品種較多的食品、農業(yè)等領(lǐng)域，必須挑選雜散光小的儀器。 

光度噪聲： 
      分析測試誤差的主要來(lái)源，且限制被分析試樣濃度的下限。 

光度噪聲一定時(shí)，濃度越低，分析測試的數據的誤差就越大，故對待測試樣的濃度下限限制較大； 
生化、海洋研究等領(lǐng)域，必須挑選光度噪聲小的儀器。 
光譜帶寬 

一般常規的在可見(jiàn)光區的分析工作，帶寬一般選擇4nm； 
用于制藥行業(yè)的藥檢，光譜帶寬在2nm或以下； 
科研工作建議選擇可調帶寬的儀器。 
可    靠    性：從狹義上講，可靠性就是儀器的故障率。 

從廣義上講，可靠性應從分光光度計的制造和使用兩個(gè)方面衡量，包括光度準確度、穩定性、故障率及售后服務(wù)等內容。 

影響可靠性的因素：首先要查看自己對儀器條件（如光譜帶寬、掃描速度、采樣間隔、標尺設定等）的選擇是否恰當，是否對儀器進(jìn)行了調零、基線(xiàn)校正、暗電流校正等； 
要嚴格檢查影響儀器光度準確度的主要指標：雜散光、光學(xué)元件（尤其是舊機器）、光度噪聲、基線(xiàn)平直度； 
檢查比色皿是否被污染； 
查看周?chē)�有無(wú)干擾源，主要是電和磁的干擾； 
檢查試樣制備的過(guò)程； 
檢查試樣是否過(guò)期等等。